GB/T35900.1-2018
前言
GB/T35900（动物流感检测》目前分为3个部分： 第1部分：H1亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法； 第2部分：H3亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法： 第3部分：H1和H3亚型流感病毒核酸双重荧光RT-PCR检测方法. 本部分为GB/T35900的第1部分。
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
本部分由中华人民共和国农业部提出。
本部分由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。
本部分起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国农业大学。
本部分主要起草人：乔彩霞、谷强、高志强、刘环、蒲静、张鹤晓、刘金华、孙洪磊、张伟、张利峰。
GB/T35900.1-2018
引言
本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到本文件4.1.8与“检测H1和H3亚型 流感病毒的核苷酸序列和试剂盒”相关的专利的使用。
本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。
该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意向任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。
该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。
相关信息可以通过以下 联系方式获得： 专利持有人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。
地址：北京市朝阳区甜水园街6号。
请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。
本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。
GB/T 35900.1-2018
动物流感检测 第1部分：H1亚型流感病毒核酸荧光 RT-PCR检测方法
1范围 GB/T35900的本部分规定了检测H1亚型流感病毒核酸的荧光RT-PCR操作方法， 本部分适用于猪和禽及其产品中H1亚型流感病毒核酸的检测。
2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19438.1-2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。
荧光RT-PCR实时荧光反转录聚合酶链反应（real-time reverse transcript polymerase chain re action) Cr（或Cp）值每个反应管内的荧光信号量达到设定的阔值所经历的循环数（cyclethreshold，or crossing point) cRNA互补RNA（plementRNA) DEPC焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） FAM骏基荧光素（carboxyfluorescein） LNA锁核酸（lockednucleic acid） PBS磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline） RNA核糖核酸（ribonucleicacid） TAMRA骏基四甲基罗丹明（carboxytetramethylrhodamine） 4试剂和材料 4.1试剂 4.1.1总则：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装。
4.1.2TRlzol：2C~25C保存. 4.1.3氧仿：2C~8C预冷。
4.1.4异丙醇：一20C预冷。
GB/T 35900.1-2018 4.1.5DEPC水：见附录A中A.1。
4.1.675%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20C预冷。
4.1.7PBS（含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素）：配方见A.2. 4.1.8引物、探针序列及反应液配方：见附录B。
4.1.9阳性对照为灭活的H1亚型动物流感病毒或体外转录的H1亚型流感病毒HA基因cRNA溶 液：阴性对照为已知流感病毒阴性的动物组织悬液。
4.2仪器设备及耗材 4.2.1荧光PCR检测仪及配套反应管（板） 4.2.2高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于120001/ 4.2.3台式离心机。
4.2.4振荡器。
4.2.5组织匀浆器。
4.2.6冰箱（2℃20C两种）。
4.2.7微量移液器（5L、10μL、100gL、1000pL）及配套吸头（无核酸酶）. 4.2.81.5ml离心营（无核酸两） 5实验室的标准化设置与生物安全管理 本方法的实验室设置与管现见B/T录C实验室生物安全管理见GB19489 6样品的采集与前处理 6.1总则 采样过程中样本不得交叉污，采样及样品前处理过程中应戴一次性手 6.2采样及处理工具 6.2.1采样专用商品化棉减子、剪刀、镊子、研体、5mL采样管、一次性采样袋。
6.2.2除棉拭子和采单袋外，上述取样工具应经121C士2C，15min高压天并烘干或经160C干 烤2h。
6.3样品采集 6.3.1拭子样品 活动物采集拭子样品，根据动物种类可采集咽啦拭子、泄殖腔拭子（禽类）或鼻拭子（猪），采集方 法如下： 取咽喉拭子时将拭子深人喉头及上额裂来回刮2次~3次并旋转，取分液； 取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔旅转一圈并沾取少量粪便： 一取鼻拭子时将拭子深人鼻腔来回刮2次～3次并旋转，取分泌物。
将采样后的拭子放人盛有2.0mLPBS（含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素）的采样管中，编号。
6.3.2组织样品 病死动物采集肺脏或气管等组织，用无菌剪、锻采集待检组织，装人一次性采样袋或其他灭菌容 2
GB/T 35900.1-2018 器，编号。
6.4样品购运 样品采集后置保温箱中，加入预冷的冰袋，密封，24h内远实验室。
6.5样品处理 6.5.1拭子样品
人无菌的1.5mL离心管中，编号备用。
6.5.2组织样品 用无菌的剪刀和镊子的取待检样品2.0g于研体或组织匀浆器中布分研后：再加10.0mLPBS（含 牛血清白蛋白、青霉素和链霉）混匀，300r/min离心5min后，取1.0mL上清液转人无菌1.5ml 灭菌离心管中，编号备用。
6.6样品存放 采集或处理好的样品在C&C条件王保存球不超过24h：若需长期保存，应放置一70C冰箱， 但应避免反复冻融冻融不超过3次上 7操作方法 7.1样品核酸提取 7.1.1在样本制备区进行，采取工Hlzol裂解法提联；也可采用其他等效的RNA提取方法。
7.1.2待检样品、用性对照和期性对照的份数总和用表示，取n个火菌1.5ml离心管，适管编号。
7.1.3每管加600LTRol 7.1.4每管对应编号步别加大200gL待检样品、阳性对照或阴性对照，混匀。
7.1.5每管加人0L氧仿，充分顺倒混匀.于4C、12000r/min离心15m. 7.1.6新取n个灭南的1.5mL离心管，逐管编号，每管加人500L异丙醇-20及预冷）。
7.1.7吸取本标准7.1.各管中的上清液500uL，转移至7.1.6相应舶管中，免吸出中间层，颠倒 混匀， 7.1.8于4C、12000r/min离心15min，轻轻倒去上滑，倒置于吸水上，洒干液体，不同样品应在吸 水纸不同地方沥干。
7.1.9每管加入600μL75%乙醇（一20C预冷）.顺倒洗涤。
7.1.10于4C、12000r/min离心10min，轻轻倒去上清，例置于吸水纸上，沥干液体，不同样品应在 吸水纸不同地方浙干。
7.1.114000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量移液器尽量将其吸干.注意一 份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面。
7.1.12室温干燥3min，不宜过于干燥，以免RNA不溶。
7.1.13每管加人11gLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA.2000r/min离心5s，获得RNA溶 液，冰浴保存备用（4C保存不超过8h，若需长期保存应放置-70C冰箱）。
7.2扩增试剂的准备与配制 7.2.1在反应混合物配制区进行。
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