NY
中华人民共和国农业行业标准
甘蔗花叶病毒检测技术规范
Technical criterion of Sugarcane mosaicvirus detection
中华人民共和国农业部发布
前言
本标准的附录A、附录B为规范性附录.
本标准由中华人民共和国农业部提出.本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口.本标准起草单位：中国热带农业科学院热带生物技术研究所、国家重要热带作物工程技术研究中心.本标准主要起草人：刘志昕、王健华、陈业满.
甘蔗花叶病毒检测技术规范
警告一使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验.本标准并未指出可能的安全问题.使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件.
1范围
本标准规定了甘蔗花叶病毒（Sugarcanemosaicvirus，SCMV）双抗夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）及反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）分子生物学检测方法.
本标准适用于甘蔗种墓、甘蔗组培苗中的甘蔗花叶病毒的检测.
2仪器和用具
2.1主要仪器
台式冷冻离心机、PCR仪、水平电泳装置、凝胶成像系统、水浴锅、酶标仪、恒温培养箱.
2.2用具及耗材
微量移液器、研体、酶联板、离心管、PCR管、移液器吸头.
3取样
3.1种茎：取腋芽及其周围组织约10g，心叶约10g，4C条件下保存，最多存放7d3.2组培苗：取叶片1g~10g，4℃条件下保存，最多存放7d.
4检测方法
4.1双抗夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）法
4.1.1样品制备
从取样（保存）材料中切取0.5g~1.0g组织，加入5mL抽提缓冲液研磨，4000r/min离心5min，取上清液作试样，4C条件下保存备用.
阳性样品为已知带SCMV的材料或试剂盒提供的阳性对照，阴性样品为已知不带SCMV的材料或试剂盒提供的阴性对照，按同样方法制备和保存.
4.1.2操作步骤
4.1.2.1包被抗体：每孔加100gL用包被缓冲液按工作浓度稀释的SCMV抗体，37℃C保湿孵育2h~4h或4C条件下保湿过夜.
4.1.2.2洗板：用PBST洗液洗板4次，每次3min~5min.
4.1.2.3封闭：每孔加入200pL封闭液，37C保湿孵育1h~2h.
4.1.2.4洗板：同4.1.2.2.
4.1.2.5加检测样品：每孔加入100gL试样，设阴性、阳性和空白对照（样品提取缓冲液），可根据需要 设置重复，37℃条件下保湿孵育4h，或4℃条件下过夜.
4.1.2.7加酶标抗体：每孔加人100gL经ECI缓冲液稀释至工作浓度的碱性磷酸酯酶标记抗体，37℃保湿辨育2h~4h
4.1.2.8洗板：同4.1.2.2.
NY/T 1804-2009
4.1.2.9加底物溶液：每孔加入100gL含1mg/mLPNP的底物显色缓冲液，在室温下避光保湿孵育30 min~60 min.
（ODos），并打印结果.
4.1.3结果判定
样品OD值/阴性对照OD值大于或等于2，判为阳性；样品OD值/阴性对照OD值小于或等于1.5时判为阴性；样品OD值/阴性对照OD值在1.5~2之间，应经进一步确认.
4.2反转录-多聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法
4.2.1引物
上游引物SCMV-F5：5'-GAAGAWGTYTTCCAYCAAKCWGGAAC-3′(W=T/A Y=C/T K=G/T);
下游引I物SCMV-R3：5'-AGCTGTGTGTCTCTCTGTATTCTC-3’；
预期扩增片段为906bp.
4.2.2操作步骤
4.2.2.1总RNA提取
从取样（保存）样品中切取1g样品，加液氮在大小合适的离心管或研体中研磨成粉末，转至2mL离心管，加600gL水饱和酚与600gL2×RNA抽提缓冲液，混匀，4C 12000r/min离心20min，上清转移至新离心管，加人等体积4mol/LLiCl，混匀后4C沉淀过夜，4℃12000r/min离心20min，沉淀用 70%乙醇漂洗数次，风干，用30LDEPC处理过的水溶解，一70C保存备用.采用RNA提取试剂盒的，操作步骤参照产品说明书.
阳性样品为已知带SCMV的材料或SCMV提纯液，阴性样品为已知不带SCMV的材料，按同样方法制备和保存.
4.2.2.2反转录及PCR反应
以样品总RNA，以及阴性、阳性对照总RNA为模板，可选用一步法RT-PCR试剂盒进行反转录和PCR扩增，实验步骤按产品说明书进行.
若不是采用一步法RT-PCR试剂盒，以SCMV-R3为反转录引物，参照反转录酶产品说明合成3次重复.
性30s，50°℃C退火30s，72℃延伸1min）：72C延伸5min.取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测 以4000r/min离心10s后，将PCR管放人PCR仪中，94C预热4min；进行35次扩增环（94C变或4C条件下保存备用.
4.2.2.3扩增产物的电泳检测
将适量的琼脂糖加人1XTAE缓冲液中，加热将其溶解，配制成琼脂糖浓度为1%的溶液，然后按每100mL琼脂溶液中加入5uL澳化乙锭溶液的比例，加人澳化乙锭溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒（需和上样缓冲液混合），其中一个泳道中加人DNA分子量标记，接通电源进行电泳. 人电泳板上，室温下凝固成概胶后，放人1XTAE缓冲液中.在每个泳道中加人7.5L的PCR产物
4.2.2.4凝胶成像分析
电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统成像仪上或紫外投射仪上成像，根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带的大小，将电泳结果形成文件存档或用照相系统拍照.
4.2.3结果判定
如果阳性对照和检测样品中同时出现目的扩增条带，而明性对照、空白对照均不出现该条带，该样品判为阳性：
如果阳性对照出现目的扩增条带，面阴性对照、空白对照及检测样品中均不出现该条带，则该样品判为阴性；
如果空白、阴性对照出现目的条带，或阳性对照未出现目的条带，应重新进行RT-PCR检测.
