NY
中华人民共和国农业行业标准
胡椒种苗黄瓜花叶病毒检测技术规范
Technicalcriterion of Cucumber mosaic virus detection on pepper
中华人民共和国农业部发布
本标准的附录A、附录B为规范性附录.本标准由中华人民共和国农业部提出.本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口.心. 本标准起草单位：中国热带农业科学院热带生物技术研究所、国家重要热带作物工程技术研究中本标准主要起草人：刘志昕、王健华、牛立霞、陈业渊.
胡椒种苗黄瓜花叶病毒检测技术规范
警告一使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验.本标准并未指出可能的安全问题.使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件.
1范围
本标准规定了胡椒种苗黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicuirus，CMV）双抗夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）及反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）分子生物学检测方法.
本标准适用于胡椒插条苗以及插条苗枝序中的黄瓜花叶病毒的检测.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
NY/T360胡椒插条苗
3仪器和用具
3.1主要仪器
台式冷冻离心机、PCR仅、水平电泳装置、凝胶成像系统、电冰箱、水浴锅、酶标仪、恒温培养箱.
3.2用具及耗材
微量移液器、研钵、酶联板、离心管、PCR管、移液器吸头.
4取样
出现花叶症状的疑似病株或插条苗（见NY/T360），取显症叶片3片～5片：无症状植株或插条片剪取适量叶片组织，制备成混合样品. 苗，取完全展开的淡绿期叶片3片～5片，于4℃条件下保湿存放待检，最多存放7d.制样时从不同叶
5检测方法
5.1双抗夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）法
5.1.1样品制备
取上清液作试样，4℃条件下保存备用. 从取样（保存）材料中切取0.5g~1.0g组织，加人5mL抽提缓冲液研磨，4000r/min离心5min，
阳性样品为已知带CMV的材料或试剂盒提供的阳性对照，阴性样品为已知不带CMV的材料或试剂盒提供的阴性对照，按同样方法制备和保存.
5.1.2操作步骤
4h或4C条件下保湿过夜.5.1.2.2洗板：用PBST洗液洗板4次，每次3min~5min.
5.1.2.1包被抗体：每孔加100L用包被缓冲液按工作浓度稀释的CMV抗体，37C保湿孵育2h~
5.1.2.3封闭：每孔加入200puL封闭液，37C保湿孵育1h~2h.
NY/T 1805-2009
5.1.2.4洗板：同5.1.2.2.5.1.2.5加检测样品：每孔加人100μL试样，设阴性、阳性和空白对照（样品提取缓冲液），可根据需要设置重复，37C条件下保湿孵育4h，或4C条件下过夜.5.1.2.6洗板：同5.1.2.2.5.1.2.7加酶标抗体：每孔加人100L经ECI缓冲液稀释至工作浓度的碱性磷酸酯酶标记抗体，37℃ 保湿孵育2h~4h.5.1.2.8洗板：同5.1.2.2.5.1.2.9加底物溶液：每孔加人100μL含1mg/mLPNP的底物显色缓冲液，在室温下避光保湿孵育30 min~60 min 5.1.2.10终止反应；每孔加入50uL3mol/LNaOH终止反应，在酶标仪上测定波长405nm吸光值
（ODus），并打印结果.
5.1.3结果判定
样品OD值/阴性对照OD值大于或等于2，判为阳性；样品OD值/阴性对照OD值小于或等于1.5时判为阴性；样品OD值/阴性对照OD值在1.5至2之间，应经进一步确认.
5.2反转录-多聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法
5.2.1引物
上游引物P1：5'-GATGGACAAATCTGAATC-3';预期扩增片段大小为657bp.
5.2.2操作步骤
5.2.2.1总RNA提取
取1g样品加液氮在大小合适的离心管或研体中研磨成粉末，转至2mL离心管，加600uL水饱和酚与600L2×RNA抽提缓冲液，混匀，4C12000r/min离心20min，上清液转移至新离心管，加人等干，用30pLDEPC处理过的水溶解，一70C保存备用.采用RNA提取试剂盒的，操作步骤参照产品说 体积4mol/LLiCl，混匀后4C沉淀过夜，4℃12000r/min离心20min，沉淀用70%乙醇漂洗数次，风明书.
阳性样品为已知带CMV的材料或CMV提纯液，阴性样品为已知不带CMV的材料，按同样方法制备和保存.
5.2.2.2反转录及PCR反应
以样品总RNA，以及阴性、阳性对照总RNA为模板，可选用一步法RT-PCR试剂盒进行反转录和PCR扩增，实验步骤按产品说明书进行.
若不是采用一步法RT-PCR试剂盒，以P2为反转录引物，参照反转录酶产品说明合成cDNA，然后，在PCR反应管中依次加人10×PCR缓冲液3L、10mmol/L的四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP)混合液2.5μL引物溶液（含上下游引物）各2μL、cDNA模板20ng~25ng、 TaqDNA聚合酶（5U/uL）0.5pL，根据cDNA模板的用量加人无菌重蒸馏水，使PCR反应体系达到30L，每个试样3次重复.
以4000r/min离心10s后，将PCR管放人PCR仪中.94C预变性2min；94C变性30s，54C退火30s 72C延伸1min，30个循环，最后72C延伸10min.取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4C条件下保存.
5.2.2.3扩增产物的电泳检测
将适量的琼脂糖加入1×TAE缓冲液中，加热将其溶解，配制成琼脂糖浓度为1%的溶液，然后按
每100mL琼脂糖溶液中加人5L溴化乙锭溶液的比例，加入澳化乙锭溶液，混匀，稍冷却后，将其倒入电泳板上，室温下凝固成凝胶后，放入1XTAE缓冲液中.在每个冰道中加入7.5gL的PCR产物（需和上样缓冲液混合），其中一个泳道中加入DNA分子量标记，接通电源进行电泳.
5.2.2.4凝胶成像分析
电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统成像仪上或紫外投射仪上成像，根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带的大小，将电泳结果形成文件存档或用照相系统拍照.
5.2.3结果判定
如果阳性对照和检测样品中同时出现目的扩增条带，面阴性对照、空白对照均不出现该条带，该样品判为阳性；
如果阳性对照出现目的扩增条带，面阴性对照、空白对照及检测样品中均不出现该条带，则该样品判为阴性；
如果空白、阴性对照出现目的条带，或阳性对照未出现目的条带，应重新进行RT-PCR检测.
