QB
中华人民共和国轻工行业标准
牙膏中蛋黄球蛋白（IgY)活性效价测定方法
Determination of immunoglobulin egg yolk in toothpastes
中华人民共和国工业和信息化部 发布
前 言
本标准按GB/T1.1-2009进行编写.本标准由中国轻工业联合会提出.本标准由全国牙膏蜡制品标准化中心归口.本标准起草单位：上海美加净日化有限公司.本标准主要起草人：陈健芬、张琰、孙东方、李显波、孙晓青.
引言
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann、荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）.ELISA法已被国际组织ASTM(American Society forTesting and Metierial)公认是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法.由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，已被广泛应用在免疫学检验的各领域中.它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定.测定的对象可以是抗体也可以是抗原.本方法测定的对象是用变形链球菌ATCC25175和亲缘链球菌ATCC0715免疫产蛋母鸡，从其鸡蛋黄中提取的抗龋齿IgY抗体在牙膏中的活性效价.
牙膏中蛋黄球蛋白（IgY）活性效价测定方法
1范围
本标准规定了牙膏中蛋黄球蛋白（IgY）活性效价的检测方法.本标准适用于牙膏中添加蛋黄球蛋白（IgY）活性效价的测定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备(NEQISO6353-1:1982)GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(NEQISO3696:1987)
3试验方法
本标准所用试剂和水，除特殊规定外，均为分析纯试剂和符合GB/T6682规定的水.
本标准中分析用标准滴定溶液、试验方法中所用制剂和制品，除特殊规定外，均按GB/T601和GB/T603的规定制备.
3.1原理
利用抗原-抗体特异性免疫反应的原理，将抗原包被于酶标板上，加入特异性IgY抗体反应，再加标有辣根过氧化酶的抗IgY的第二抗体，最终加入酶的底物，使酶催化底物显色，结果为阳性且稀释比最大的为最终效价比.
3.2仪器和设备
a）96孔酶标板：b）移液枪2把，量程分别为：10μL~100μL、100μL~1000μL;c） 微量进样器：精确度0.50μL，量程0μL~25μL；d）分析天平：精确至0.001g;）电热恒温箱：精度土1℃；f）冰箱：精度±1°℃；g）酶标仪：型号MultiskanMK3或相当仪器.
3.3生化试剂
a）抗原：将菌浓度为2×10?cfu/mL的变形链球菌ATCC25175和亲缘链球菌ATCC0715灭活制得；b）酶标第二抗体：兔抗鸡IgG辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗.
3.4试剂配制
3.4.1包被缓冲液：准确称取Na2COg1.59g、NaHCO2.93g，加双蒸馏水定容至1000mL，得到0.05mol/L的碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，4℃保存，有效期14天.3.4.2稀释抗原：用包被缓冲液稀释抗原至合适浓度.变形链球菌ATCC25175和亲缘链球菌ATCC0715的抗原用包被缓冲液稀释（即1份抗原加4份包被缓冲液）.3.4.3洗涤液（PBST）：准确称取NaC120.20g、KH2PO40.20g、Na2HPO4.12H2O2.83g，加Tween-205.0mL，加双蒸馏水定容至1000mL，4C保存，有效期3个月.3.4.4稀释液（PBS)：准确称取NaC18.0g、KH2PO40.20 g、Na2HPO4.12H2O 2.90g、KC10.20g，加双蒸馏水定容至1000mL，4℃保存，有效期3个月.
QB/T4363-2012
3.4.5封闭液：1%牛血清白蛋白（0.1g牛血清白蛋白加10mlPBS）.
3.4.6酶标第二抗体的稀释：用PBS将酶标第二抗体按1:6000的浓度稀释，每次使用应做到现用现稀释.
3.4.70.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液：准确称取CgHgOzH2O7.30g、Na2HPO412H2O23.90g，加双蒸馏水定容至1000mL，4°C保存，使用前将其恢复至室温后使用，有效期3个月.
3.4.8底物液：准确量取0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液15.0mL，加0.008g邻苯二胺以及5uL~10uL30%H2O2
注：底物液应配制在避光的棕色瓶内，且应现用现配，底物液为无色液体，若使用前底物液呈现黄色，则应重新配制.
3.4.9终止液（2mol/L硫酸溶液）：准确称取98%浓硫酸20.0g，将浓硫酸缓慢加入到60mL双蒸馏水中，最终定容至100mL.
3.5检验程序
3.5.1包被抗原：每个待测样品应做不少于2组平行样，并且在不同酶标板上进行测试时，每块酶标板都要做空白以及阴性对照，各不少于2孔（阴性对照加PBS）.每孔加100μL稀释的抗原（空白除外），置于4C条件下，12h后方可使用（包被后抗原应在72h内用完）.
3.5.2封闭：酶标板每孔加封闭液200μL（空白除外），置于37°C条件下，40min后甩干，在每孔内加满PBST，振摇1min，甩干，重复洗涤3次，最后在吸水纸上拍干.
3.5.3处理样品：称取10.0g牙膏，加入70.0mLPBS，搅拌2h~3h，置于4℃条件下，12h后方可使用.取上清液于3000r/min离心10min，吸取上清液（即为1:8样品液）待用（处理后的样品应置于4℃条件下，在12h内用完）.
3.5.4加处理后的样品：先将包被后的抗原甩干，在每孔内加满PBST，振摇1min，甩于，重复洗涤3次，最后在吸水纸上拍干.将上清液按梯度（1:8、1:16、1:32.1:1024、1:2048）对倍稀释，按对倍稀释的梯度每孔各100uL加入酶标板中，置37℃条件下，2h后甩干，在每孔内加满PBST，振摇1min，甩干，重复洗涤3次，最后在吸水纸上拍干.
3.5.5加入酶标第二抗体：每孔加入100uL酶标第二抗体（空白除外），置37C条件下，40min后甩干，在每孔内加满PBST，振摇1min，甩干，重复洗涤3次，最后在吸水纸上拍干.
3.5.6加底物液：每孔加100μL底物液，避光显色，20min左右终止反应.
3.5.7终止反应：每孔加100μL终止液，10min内用酶标仪测定结果.
3.6结果判定
3.6.1效价判定以酶标仪显示的结果为准.效价等于测定样本孔吸收值（P）除以一组阴性样本测定孔平均吸收值（N）.当P/N不小于2.1时，为阳性.阳性临界值为，X等于N乘以2.1，OD值不小于X值为阳性.取平均数据均为阳性且稀释比最大的那组为效价的最终判定结果，阴性表示没有效价.
3.6.2当发生下列任一情况时，应重新取样进行检测：
a）空白或阴性对照显色不正常，影响测定结果的判断；b）酶标仪判定结果呈现无规律性变化；c）酶标仪的判定结果与目测显色结果存在明显差异.
