SC
中华人民共和国水产行业标准
水生动物检疫实验技术规范
The norm of experimental technique for quarantine of aquatic animals
中华人民共和国农业部发布
前言
本标准由中华人民共和国农业部渔业局提出. 本标准由全国水产标准化技术委员会归口.本标准起草单位：吉林农业大学、全国水产技术推广总站.本标准主要起草人：夏艳洁、孙喜模、江育林、钱爱东、陈爱平、陈辉、张雅斌.
本标准的附录A、附录B为规范性附录.
水生动物检疫实验技术规范
1范围
本标准适用于鲜活水生动物的检疫及初加工水产品的检疫.
本标准规定了水生动物检疫实验技术操作规范.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T18088出人境动物检疫采样
3试剂、染色液与培养基
实验中所需试剂、染色液与培养基的配制均按GB/T4789.28执行，GB/T4789.28中没有提及的试剂、染色液见附录A.
4仪器、设备
除有特殊要求外，均按微生物实验室要求准备.
5实验室用水要求
5.1制水浸片用水应符合GB/T6682中三级水的规格.5.2病毒接种及细胞培养用水应符合GB/T6682中一级水的规格.5.3聚合酶链式反应（PCR）测定用水应符合GB/T6682中一级水的规格，且要用焦碳酸二乙酯（DE-5.4酶联免疫吸附试验（ELISA）用水应符合GB/T6682中二级水的规格. PC）处理水（见附录A.1）.
6采样
6.1采样数量
对有症状的动物，挑选至少10条激死的个体；对无症状的动物，应按GB/T18088的规定，随机取一定数量的个体.
6.2个体要求
活体或刚死不久的水生动物，新鲜的初加工水产品.
已知有或怀疑有病原存在的组织或器官.
7症状检查
7.1水中活动情况
SC/T 7014-2006
观察是否离群独游或有其他异样游动情况，对惊吓敏感程度，摄食是否正常等.必要时对饲养环境进行调查，如对水温（z）、溶解氧（DO）、酸碱度（pH）、氨氮（NH）、亚确酸盐（NO）、化学耗氧量（COD）等理化指标进行测定.
7.2外部检查
7.2.1鱼类
化，有无竖鳞、疮等现象，有无胞囊及其他寄生虫寄生等情况. 体形体色的变化，体表黏液的多少，有无充血、出血等症状，鳍条、鳞片等损伤情况，鳃黏液及颜色变
7.2.2虾类
体色及体表光滑情况，肠道食物的充盈程度，有无附着物，有无白斑、红体情况，肌肉丰满程度，有无附肢溃烂、断残等情况.
7.2.3蟹类
甲壳光滑程度、硬度，有无损伤情况，壳面有无溃疡、红色或棕色斑点，附肢残断或再生情况，有无附着物或其他寄生虫寄生等情况.
7.2.4贝类
贝壳关闭情况，贝壳有无剥落或穿孔情况，出水孔喷水情况，出水时斧足收缩入壳内情况.
7.2.5蛙类
腿部及腹部等损伤情况，体表黏液情况，有无体表充血、出血情况，有无寄生虫寄生等情况.
7.2.6龟、整类
甲壳圆滑、硬度情况，损伤情况，有无溃痛、红子情况，有无附着物或寄生虫寄生等情况.
7.3解剖检查
7.3.1鱼类
仔细观察有无腹水，肝、脂肪、腺、胆、、性腺、肠道、肾、心脏、脑、脊髓、肌肉等的颜色、大小有无变化，有无寄生虫或胞囊及其他病理变化等.
7.3.2虾类
仔细观察有无烂鳃、黄及属鳃情况，仔细观察胃、性腺、肝胰腺、心脏、肌肉等的额色、大小有无变化，有无寄生虫或胞囊及其他病理变化等.
7.3.3蟹类
仔细观察有无烂鳃、黑情况，仔细观察肝胰腺、消化道、肌肉、生殖腺等的颤色，有无寄生虫或胞囊及其他病理变化等.
7.3.4贝类
贝壳打开后黏液和分泌物情况及有无气味，足丝附着情况，外套膜发黑或肿账情况，颜色及腐烂情况，内脏团颤色及瘦羽情况，有无附着物、寄生虫或胞囊寄生及其他病理变化等.
7.3.5蛙类
仔细观察胃、肠道、肝脏、胰脏、肺、心脏、肌肉、脑等的颤色、大小有无变化，有无寄生虫或胞囊及其他病理变化等.
7.3.6龟、鉴类
仔细观察食道、心脏、肝脏、胃、肠道、腺、性腺、肌肉、脑等的颜色、大小有无变化，有无寄生虫或胞囊及其他病理变化等.
7.4制片镜检
7.4.1将体外凡能接触到生活水体的各部位用弯头镊子刮取黏液，放在滴有水（海水动物用煮沸过滤海水）的载玻片上，涂沫均匀，盖上盖玻片，制成水浸片，显微镜下观察.
7.4.2将体内各组织、器官用弯头镊子取少部分，放在滴有生理盐水（淡水动物用0.65%，海水动物用0.75%）的载玻片上，涂沫均匀，盖上盖玻片，制成水浸片，显微镜下观察.8病毒分离与鉴定8.1分离病毒8.1.1取样部位 有明显病灶的取病灶部位，无明显病灶的：幼苗取整体，若有卵黄则除去；全长4cm～6cm鱼取头部、内脏；全长6cm以上鱼取脑、肝、肾、牌，若为怀卵鱼则包括卵巢液.8.1.2样品处理8.1.2.1将所采样切成小块用含双抗的磷酸盐缓冲液（PBS）（见附录A.2）洗2次.8.1.2.2样品剪碎、勾浆，用10倍体积的199充分悬浮，25℃，1h～2h. 8.1.3分高病毒8.1.3.13000r/min，离心30min，收集上清液，4C过夜.8.1.3.2接种24h以内的新鲜敏感细胞.8.2病毒鉴定8.2.1氯仿敏感试验有囊膜.--正常细胞，用无IUDR的培养液培养（正营对照）；
8.2.1.1将1mL病毒样品液加人一密封容器内，另取1mL作对照.8.2.1.2加1mL氯仿，对照加1mL199培养液于室温下间歇振荡10min.8.2.1.4测定处理样品和未处理对照样品中病毒的半数细胞培养感染量（TCIDs）（方法见附录B）. 8.2.1.3将氯仿处理样品及未处理对照样品同时于1000r/min，离心5min，取上层水相.8.2.1.5如果病毒经过氧仿处理后比未处理对照降低2个滴度以上，则认为对脂溶剂敏感，病毒可能8.2.2吖啶橙（AO）试验8.2.2.1有接种了病毒样品的，附有敏感细胞的盖玻片，PBS洗.8.2.2.3依次于95%、75%、50%、25%乙醇中各2mino 8.2.2.2加Carmoy’s固定液（见附录A.3），固定15mine8.2.2.4加Mcilvain’s缓冲液（见附录A.4)，8min.8.2.2.5加0.01%吖啶橙染色液（见附录A.5)5min.8.2.2.6加Meilvain’s缓冲液，3min.8.2.2.710%甘油缓冲液封片.8.2.2.8荧光显微镜镜检，吖啶橙染色后双链核酸经紫外光照射发出绿光，而单链核酸发出红光.8.2.3DNA抑制剂（5-碘脱氧尿苷，即IUDR）抑制试验8.2.3.1将细胞传人24孔板或96孔板，24h内长成单层.
8.2.3.2吸出培养液，加人含50pgIUDR/mL的199与HEPES（4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸）混合液.8.2.3.312h后，将待测病毒液用上述含IUDR的培养液10倍系列稀释.8.2.3.4接种到细胞板，每稀释度接3孔，每孔0.1mL，根据细胞不同，选择不同温度培养.8.2.3.512h~24h后换人不含IUDR的培养液，继续培养观察7d，计算TCID值.8.2.3.6IUDR的浓度对检验结果的影响很大，因为它对细胞和病毒都有毒性，所以要有以下对照：-正常细胞，用含IUDR的培养液培养（IUDR毒性对照）；
