NY
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4656-2025
动物源产气英膜梭菌分离与 鉴定技术规程
Technical code of practice for isolation and identification ofClostridiumperfringensfromanimals
中华人民共和国农业农村部 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由农业农村部畜牧兽医局提出.
本文件由全国兽药残留与耐药性控制专家委员会归口.
本文件起草单位：中国农业大学、中国兽医药品监察所.
本文件起草人：王少林、赵琪、吴聪明、张纯萍、张仕泓、王鹤佳、周宇晴、徐土新、陈安杰、崔明全、李霆、程敏.
动物源产气荚膜梭菌分离与鉴定技术规程
1范围
本文件确立了动物源产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）分离与鉴定的程序，规定了样品采集与保存运输、分离纯化、筛查与鉴定、菌种保藏、生物安全要求的操作指示，描述了相应的试验方法.
本文件适用于动物源细菌耐药性监测对动物直肠/泄殖腔拭子、新鲜粪便、肠道内容物等样品中产气荚膜梭菌的分离和鉴定.
2规范性引用文件
日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该
GB4789.13食品安全标准食品微生物学检验产气英膜梭菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则NY/T4141动物源细菌耐药性监测样品采集技术规程
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义.
4试剂或材料
4.1要求
除另有规定外，试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的三级水，培养基按附录A配制或用商品化产品.
4.2试剂
4.2.1灭菌液体石蜡.4. 2.2PCR 预混液（2×PCR Master Mix).4.2.350×TAE缓冲液.4.2.4琼脂糖.4. 2. 5 DNA Marker(2 000 bp) -4.2.6α-氰-4-羟基肉硅酸（HCCA）.4.2.7甘油.
4.3.11×TAE缓冲液：取50×TAE缓冲液20mL，加水至1 000mL.4.3.21%琼脂糖凝胶：取琼脂糖1.0g，于100mL1XTAE中加热，充分溶解.4.3.3基质溶液：取α-氰-4-羟基肉硅酸（HCCA），按说明书配制或用市售商品.4.3.4灭菌甘油：取甘油适量，121“C高压灭菌20min.
4.4培养基制备
4.4.1Amies运送培养基：按照附录A中A.1的规定执行.4.4.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）：按照A.2的规定执行.
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4.4.3胰陈-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基（TSC)：按照A.3的规定执行.4.4.45%绵羊血琼脂培养基：按照A.4的规定执行.4.4.55%蔗糖脱脂乳保护剂：按照A.5的规定执行.
产气英膜梭菌毒素C型（Clostridiaurm perfringenx，Type C)[CVCC 60101].
4.6.1无菌脱纤维绵羊血.4.6.2生化鉴定试剂盒或鉴定卡.4.6.3细菌DNA提取试剂盒.4.6.4磁珠保藏管.
5仪器设备
5.1二级生物安全柜.5.2冰箱：2℃~8℃，-20C或以下.5.3分析天平：感量0.01g.5.4精密天平：感量0.001g.5.5移液器：0.5 pl~1 000gzl.5.6恒温培养箱. 5.7厌氧培养装置.5.8微生物生化鉴定系统.5.9PCR仪.5.10高速冷冻离心机：离心速度≥12000r/min.5.11核酸电泳仪.5.12电泳凝胶成像分析系统，5.13微生物质谱仪（MALD1-TOF MS).
6分离鉴定程序
分离与鉴定流程见图1.
图1产气英膜梭菌分离与鉴定流程
