猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒 2型三重荧光PCR检测方法
Triplex real time PCR detection method for porcine pseudorabies virus
porcine parvovirus and porcine circovirus type2
中国兽医协会 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本标准由中国海关科学技术研究中心提出.
本标准由中国兽医协会归口.
本标准起草单位：中国海关科学技术研究中心、沈阳海关技术中心、中国动物疫病预防控制中心、成都海关技术中心、长沙海关技术中心.
本标准主要起草人：杜思乐、史喜菊、王素秋、徐立伟、任彤、赵相鹏、白子龙、周智、高志强、耿庆华、林华、汪琳、张伟、蒲静、张小寒、邓丛良、刘全国、禹思宇.
猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型三重荧光PCR 检测方法
1范围
本文件规定了猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型三重荧光PCR检测方法操作规程.本文件适用于猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的鉴别检测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.BHQ：黑洞淬灭基团（Black HoleQuencher）Cy5：花青素5（Cyanine5）DEPC：焦碳酸二乙酯（Dicthyl pyrocarbonate）FAM：6-羧基荧光素（6-Carboxyfluorescein） HEX：六氯-6-甲基荧光素（6-Hexachlorofluorescein）PCV-2：猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus type 2）PRV：猪伪狂犬病毒（Porcine Pseudorabies Virus）PPV：猪细小病毒（Porcine Parvovirus）
5仪器与设备
5.1多通道荧光PCR仪.5.2生物安全柜.5.3冰箱（2°℃~6°℃和-20°℃）.1
5.4台式冷冻离心机.5.5组织匀浆机.5.6水浴锅或金属浴仪.5.7涡器.5.8可调单道移液器（0.2μL~2 μuL、1μL ~10 μL、10μL~100 μuL、20uL~200 μuL 和 100 μL~ 1000μL).
6试剂和耗材
6.1试剂
6.1.1除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682的要求.试剂均用无核酸酶的容器分装.6.1.2商品化病毒总核酸提取试剂盒或其他病毒核酸提取试剂.6.1.3多重荧光定量PCR试剂.6.1.4无水乙醇.6.1.575%乙醇.
6.2阳性对照
含猪伪狂犬病毒（PRV）gE基因的体外重组质粒、含猪细小病毒（PPV）NS1基因的体外重组质粒、含猪圆环病毒2型（PCV-2）ORF2基因的体外重组质粒，序列片段序列见附录A.也可以使用其他经过确认的阳性质控品.
6.3阴性对照
猪伪狂犬病毒阴性样品、猪细小病毒阴性样品和猪圆环病毒2型阴性样品.
6.4引物和探针序列
引物和探针序列见附录B.
7生物安全要求
样品处理和核酸提取以及废弃物处理按照GB19489规定，在相应等级的生物安全实验室或者生物安全柜中进行，并做好个人防护.
8样品采集和处理
样品采集和处理应按照NY/T541有关规定进行，可以采集动物血液、组织、鼻拭子和肛拭子等.
9病毒核酸提取
病毒核酸提取见附录C.
10荧光PCR反应
10.1荧光PCR反应体系
多重荧光PCR反应体系组成见附录D.1.单重荧光PCR反应体系组成见附录D.2.
10.2荧光PCR反应程序
荧光PCR反应程序见附录D.3.
10.3结果描述及判定
10.3.1试验成立条件
Cy5和HEX）均无扩增曲线且Ct≥40或者无值.满足此条件，视为此次试验有效. 阳性对照（FAM、Cy5和HEX）均出现S形扩增曲线且Ct≤30，阴性对照和空白对照（FAM、
10.3.2结果判定和鉴别
10.3.2.1有典型扩增曲线且Ct≤35，判定为核酸检测阳性：
10.3.2.2有典型扩增曲线，但35<Ct<40，属于疑似区间，需要重新确认，建议使用单荧光PCR方法确认：如果Ct值仍然<40，则判定为核酸检测阳性，如果Ct值≥40或者无Ct值，判定为核酸检测阴性. 10.3.2.3没有扩增曲线，或者Ct≥40，判定核酸检测阴性. HEX阳性荧光信号表示PPV核酸检测阳性：两种阳性荧光信号表示对应的其中两种病毒核酸检测阳性， 10.3.2.4FAM阳性荧光信号表示PCV-2核酸检测阳性，Cy5阳性荧光信号表示PRV核酸检测阳性，三种阳性荧光信号表示PCV-2、PRV和PPV三种病毒核酸检测阳性，结果鉴别见表1. 表1结果鉴别 荧光信号阴阳性 病毒核酸检测结果FAM ( ) PCV-2核酸检测阳性Cys ( ) PRV核酸检测阳性FAM ( ) Cy5 ( ) HEX ( • ) PCV-2和PRV核酸检测阳性 PPV核酸检测阳性FAM ( ） HEX ( ) PCV-2和PPV核酸检测阳性Cy5 ( ) HEX ( ▪) PRV和PPV核酸检测阳性FAM ( •) Cy5 ( ) HEX ( ) PCV-2、PRV和PPV核酸检测阳性
