准
T/GDAAV0611-2025
鹦鹉热衣原体超快速荧光PCR检测 技术规范
Technical Specification for Ultra-fast Real-time PCR Detection ofChlamydiaPsittaci
广东省畜牧兽医学会 发布
目次
1范围..... 前言. 112规范性引用文件3术语和定义..3.1超快速荧光PCR4缩略语..5试剂和耗材，5.1试剂..5.2引物和探针..6仪器设备7样品采集与处理.7.1生物安全措施.7.2样品采集.7.3样品前处理.8操作方法.8.1样品核酸提取..8.2反应体系的配制.8.3超快速荧光PCR反应9质控标准与结果判定9.1阅值设定9.2质控标准9.3结果判定附录A溶液配制...附录BplUC57-OmpA重组质粒和内参的制备附录C鹦鹉热衣原体和内参引物、探针的名称、序列..附录DDNA提取方法（磁珠法）
前言
起草. 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由东莞市动物疫病预防控制中心、广东省畜牧兽医学会提出.
本文件由广东省畜牧兽医学会归口.
主要起草单位：东莞市动物疫病预防控制中心、广东省动物疫病预防控制中心、超快生物技术（广州）有限公司、广东省疾病预防控制中心、广州市疾病预防控制中心、广东省农业科学院动物卫生研究所、深圳市动植物疫病预防控制中心、珠海市动物疫病预防控制中心、海南省疾病预防控制中心、广州国家实验室、东莞市洪梅镇农业技术服务中心、东莞市东坑镇农业技术服务中心.
娜、洪伟彬、陈晶、李丹丹、李小军、张远龙、卢受昇、徐强、吴智民、赖笑娴、曾瀚熙、王晓虎、 主要起草人：张险用、叶健、刘雪怡、管知深、李柏生、吴新伟、曹蓝、柯艳坤、曾平、徐振韩霄、林仰孝、卢伟昌、李敏、谢柱彬、钟群芳、谭铭光、林梦哲.
鹦鹉热衣原体超快速荧光PCR检测技术规范
1范围
本文件描述了鹦鹉热衣原体超快速荧光PCR检测方法.本文件适用于哺乳动物、禽类和环境样品中鹦鹉热衣原体的检测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过本文件的规范性引用而成为本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB19489实验室生物安全通用要求GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1超快速荧光 PCRultra-fast Real-time PCR
一种基于快速温控模块技术（升降温速率40°C/s以上），结合快速启动酶及高特异性预混反应体系所构建的高效核酸扩增检测方法，可在8min~15min内完成45个循环反应.
4缩略语
下列缩略语适合本文件.
Ct值：阔值循环数（Cycle threshold）F:上游引物（Forward primer)R:下游引物（Reverse primer）P:探针（Probe）FAM：6-羧基荧光素（6-Carboxyfluorescein） BHQ2：黑洞淬灭剂2（Black HoleQuencher 2）MGB：Minor Groove Binder Quencher淳灭基团Cy5：近红外荧光染料（Near-infrared fluorescent dyes 5）PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution）Cps：鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci）
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）
DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid）
5.1试剂
5.1.1试验用水符合GB/T6682二级水的要求.5.1.2PBS（pH7.2）配制方法见附录A中A.1，试剂药品采用分析纯. 5.1.3阴性对照为灭菌生理盐水，配制方法按照附录A中A.2.5.1.5内参为健康猪肝脏（不含鹦鹉热衣原体），制备方法按照附录B中B.3.5.1.65×PCR buffer （含Mg²)5. 1.7 dNTP. 5.1.8快速启动聚合酶.5.1.9DNA提取试剂盒.5.1.10超快速荧光PCR反应板.
5.2引物和探针
超快速荧光PCR扩增（鹦鹉热衣原体和内参）上、下游引物和探针序列参见附录C.1.
6仪器设备
6.1超快速荧光PCR仪.6.2移液器（量程：0.5μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL）.6.3生物样品均质器.6.4冷冻高速离心机. 6.5ⅡI级生物安全柜.6.6高压灭菌器.6.7pH计.
7样品采集与处理
7.1生物安全措施
采样及样品前处理过程须戴一次性口罩、乳胶手套/丁晴手套、穿防护服，样品不得交叉污染.实验室生物安全符合GB19489规定.
7.2样品采集
7.2.1采样工具
剪刀、镊子、棉拭子、离心管、2mL组织研磨管等无菌处理.
7.2.2待检样品
样品可包括动物内脏、排泄物、喉拭子、环境拭子.动物组织：用75%酒精棉球对样品体表进行擦拭消毒后，无菌操作取适量组织：排泄物：将无菌棉拭子伸入泄殖腔内旋转一圈并沾取少量粪便：喉拭 子：将无菌棉拭子伸入喉头来回涂刮2次～3次，取咽喉分泌液：环境拭子：将无菌拭子在待采样表面来回涂抹2次～3次，采集环境样品：拭子样本采集后应立即浸入装有50%甘油-PBS缓冲液的离心管中，剪去或折断露出的拭子杆，盖紧离心管盖，密封后冷藏保存.
7.2.3样品运输 样品运输应符合NY/T541的规定.
