标
准
布鲁氏菌超快速荧光PCR检测技术 规范
Technical Specification for Ultra-fast Real-time PCRDetection ofBrucella
广东省畜牧兽医学会 发布
目次
前言....1范围..2规范性引用文件3术语和定义. -13.1超快速荧光PCR. -14缩略语... ..15试剂和耗材..5.1试剂.. .25.2引物和探针. .26仪器设备. .27样品采集与处理. 27.1生物安全措施.. .27.1样品采集.. 27.2样品前处理.. .38操作方法 .38.1DNA提取.8.2反应体系的配制8.3超快速荧光PCR反应 49质控标准与结果判定 49.2质控标准 9.1阅值设定.4附录A（规范性） 9.3结果判定 溶液配制附录B（资料性）pUC57-virBI0重组质粒和内参的制备 ..6附录C（规范性）布鲁氏菌和内参引物、探针的名称、序列 .7附录D（资料性）DNA提取方法 .10 .9
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由东莞市动物疫病预防控制中心、广东省畜牧兽医学会提出.
本文件由广东省畜牧兽医学会归口.
主要起草单位：东莞市动物疫病预防控制中心、广东省疾病预防控制中心、广东省动物疫病预防控制中心、广州市番禺区动物疫病预防控制中心、超快生物技术（广州）有限公司、海南省动物疫病预防 控制中心、广西壮族自治区动物疫病预防控制中心、深圳市动植物疫病预防控制中心、珠海市动物疫病预防控制中心、肇庆市动物疫病预防控制中心、海南省疾病预防控制中心、广州市疾病预防控制中心、广州国家实验室、深圳海关动植物检验检疫技术中心、华润五丰肉类食品（河南）有限公司深圳分公司、东莞市洪梅镇农业技术服务中心、东莞市南城农业技术服务中心.
主要起草人：张险朋、李柏生、徐振娜、胡辛凯、李彩红、管知深、迟庆安、韦正吉、李秋剑、黄争、周美芳、李丹丹、邹丽容、张欣、孙长云、吴新伟、曹蓝、徐强、韩霄、陈亮、阮周曦、王婉君、林仰孝、李小军、张远龙、卢受昇、黄伟平、曾瀚熙、谭铭光、林梦哲.
布鲁氏菌超快速荧光PCR检测技术规范
1范围
本文件描述了布鲁氏菌超快速荧光PCR检测方法.
本文件适用于细菌培养物、组织样品、动物产品、分泌物、排泄物和环境样品中布鲁氏菌的检测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过本文件的规范性引用而成为本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB19489实验室生物安全通用要求GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1超快速荧光 PCRultra-fast Real-time PCR
一种基于快速温控模块技术（升降温速率40℃/s以上），结合快速启动酶及高特异性预混反应体系所构建的高效核酸扩增检测方法，可在8min～15min内完成45个循环反应.
下列缩略语适合本文件.PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）Ct值：阔值循环数（Cycle threshold）R:下游引物（Reverse primer）P：探针（Probe）BHQ2：黑洞淬灭剂2（BlackHoleQuencher 2）FAM：6-羧基荧光素（6-Carboxyfluorescein） MGB：Minor Groove Binder Quencher洋灭基团Cy5：近红外荧光染料（Near-infrared fluorescent dyes5）
DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid）
F：上游引物（Forward primer)
PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution）
T/GDAAV 1014-2025
5试剂和耗材
5.1试剂
5.1.1试验用水符合GB/T6682二级水的要求.5.1.2PBS液（pH7.2）配制方法按照附录A中A.1，试剂药品采用分析纯.5.1.3阴性对照为灭菌生理盐水，配制方法按照附录A中A.2.5.1.4阳性对照为布鲁氏菌灭活抗原或pUC57-virB10重组质粒，重组质粒制备方法按照附录B中B.1. 5.1.5内参为健康猪肝脏组织（不含布鲁氏菌），制备方法按照附录B中B.3.5. 1. 65×PCR buffer （含 Mg²).5.1.7 dNTP.5.1.8快速启动聚合酶.5.1.9DNA提取试剂盒. 5.1.10超快速荧光PCR反应板.
5.2引物和探针
超快速荧光PCR扩增（布鲁氏菌和内参）上、下游引物和探针序列参见附录C.1.
6仪器设备
6.1超快速荧光PCR仪.6.2移液器（量程：0.5μL~10uL、10uL~100uL、100μL~1000uL）. 6.3生物样品均质器.6.4冷冻高速离心机.6.5ⅡI级生物安全柜.6.6高压灭菌锅. 6.7pH计.
7样品采集与处理
验室生物安全符合GB19489规定. 采样及样品前处理过程须戴一次性口罩、乳胶手套/丁晴手套、穿防护服，样品不得交叉污染.实
7.1样品采集
7.1.1采样工具
剪刀、镊子、注射器、棉拭子、1.5mL离心管、研磨管、采样瓶等无菌处理.
7.1.2样品采集
样品可包括动物内脏器官（淋巴结、肝脏、脾脏、生殖器官等）、分泌物（羊水、阴道分泌物、乳汁、精液、关节液等）、排泄物、细菌培养物、环境拭子.内脏器官：用75%酒精棉球对样品体表进行擦拭消毒后，无菌操作取适量组织器官.分泌物：抽取适量分泌物放入离心管内或采用棉拭子采集.细菌培养物：取适量培养液于离心管内.环境拭子：将棉拭子来回涂抹2次～3次后，立即放入装有50% 的甘油-PBS液的离心管中，剪去露出部分，盖紧离心管盖，密封后冷藏保存.
