中华人民共和国国家标准
GB 4789.6-2016
食品安全国家标准
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局 发布
前言
本标准代替GB/T4789.6-2003（食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》.本标准与GB/T4789.6-2003相比，主要变化如下： 标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验”；一增加了术语和定义、缩略语：增加了血清学试验中H抗原鉴定：一增加了附录A； 增加了PCR确认试验：修改了设备和材料：修改了培养基和试剂：修改了检验程序；删除了肠毒素试验. 修改了血清学试验中致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群：
食品安全国家标准
食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验
1范围
本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌（diarrheagenic Escherichia coli）的检验方法.本标准适用于食品中致泻大肠埃希氏菌的检验.
2术语和定义、缩略语
2.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
2.1.1致泻大肠埃希氏菌Diarrheagenic Escherichia coli
一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌，可经过污染食物引起人类发病.常见的致泻大肠埃希氏菌主要包括肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌（包括肠道出血性大肠埃希氏菌）和肠道集聚性大肠埃希氏菌.
2.1.2肠道致病性大肠埃希氏菌EnteropathogenicEscherichia coli
能够引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤，且不产生志贺毒素的大肠埃希氏菌.该菌是婴幼儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死.
2.1.3肠道侵袭性大肠埃希氏菌Enteroinvasive Escherichia coli
能够侵人肠道上皮细胞面引起痢疾样腹泻的大肠埃希氏菌.该菌无动力、不发生赖氨酸脱羧反应、抗原编码基因及其调控基因，如ipaH 基因、ipaR基因（又称为invE基因）. 不发酵乳糖，生化反应和抗原结构均近似痫疾志贺氏菌.侵入上皮细胞的关键基因是侵袭性质粒上的
2.1.4产肠毒素大肠埃希民菌Enterotoxigenic Escherichia coli
腹泻，一般呈轻度水样腹泻，也可呈严重的霍乱样症状，低热或不发热.腹泻常为自限性，一般2d～3d 能够分泌热稳定性肠毒素或/和热不稳定性肠毒素的大肠埃希氏菌.该菌可引起婴幼儿和旅游者即自愈.
2.1.5产志贺毒素大肠埃希氏菌Shiga toxin-producing Escherichia coli（肠道出血性大肠埃希氏菌Enterohemorrhagic Escherichia coli )
能够分泌志贺毒素、引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤的大肠埃希氏菌.有些产志贺毒素大肠埃希氏菌在临床上引起人类出血性结肠炎（HC）或血性腹泻，并可进一步发展为溶血性尿毒综合征（HUS），这类产志贺毒素大肠埃希氏菌为肠道出血性大肠埃希氏菌.
2.1.6肠道集聚性大肠埃希氏菌Enteroaggregative Escherichia coli
肠道集聚性大肠埃希氏菌不侵人肠道上皮细胞，但能引起肠道液体蓄积，不产生热稳定性肠毒素细胞黏附性大肠埃希氏菌. 或热不稳定性肠毒素，也不产生志贺毒素.唯一特征是能对Hep-2细胞形成集聚性黏附也称Hep-2
2.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.
2.2.1DEC：致泻大肠埃希氏菌Diarrheagenic Escherichia coli2.2.2EPEC：肠道致病性大肠埃希氏菌Enteropathogenic Escherichia coli2.2.3EIEC：肠道侵袭性大肠埃希氏菌Enteroinvasive Escherichia coli2.2.4ETEC：产肠毒素大肠埃希氏菌Enterotoxigenic Escherichia coli2.2.6EHEC：肠道出血性大肠埃希氏菌EnterohemorrhagicEscherichia coli 2.2.5STEC：产志贺毒素大肠埃希氏菌Shiga toxin-producing Escherichia coli2.2.7EAEC：肠道集聚性大肠埃希氏菌Enteroaggregative Escherichia coli2.2.8escV：蛋白分泌物调节基因，gene encoding LEE-encoded type Il secretion system factor2.2.9eae :紧密素基因.gene encoding intimin for Escherichia coli attaching and effacing 2.2.10bf pB：束状菌毛 B 基因，bundle-forming pilus B;2.2.11stx1:志贺毒素I基因 Shiga toxin one2.2.12stx2：志贺毒素基因，Shiga 1oxin two2.2.13z：热不稳定性肠毒素基因，heat-labile enterotoxin2.2.14st：热稳定性肠毒素基因，heat-stable enterotoxin 2.2.15stp （srIa）：猪源热稳定性肠毒素基因，heat-stable enterotoxins initially discovered in theisolates from pigs2.2.16sth（szIb）：人源热稳定性肠毒素基因，heat-stable enterotoxins initially discovered in the2.2.17invE：侵袭性质粒调节基因，invasive plasmid regulator isolates from human2.2.18ipaH：侵袭性质粒抗原H 基因，invasive plasmid antigen H-gene2.2.19aggR：集聚黏附菌毛调节基因，aggregative adhesive fimbriae regulator2.2.20uidA ：β-葡萄糖甘酶基因，β-glucuronidase gene2.2.21axA：集聚热稳定性毒素 A 基因，enteroaggregative heat-stable enterotoxin A 2.2.22pic ：肠定植因子基因，protein involved in intestinal colonization2.2.23LEE：肠细胞损伤基因座，Locus of enterocyte effacement2.2.24EAF:EPEC 黏附因子.EPEC adhesive factor
3设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1恒温培养箱：36℃±1C，42℃±1℃.3.3恒温水浴箱：50C士1℃C，100℃或适配1.5mL或2.0mL金属浴（95℃~100℃）. 3.2冰箱：2℃~5℃.3.4电子天平：感量为0.1g和0.01g.
3.6均质器.3.7振荡器.3.8无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度），10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头. 3.9无菌均质杯或无菌均质袋：容量500mL.3.10无菌培养Ⅲ：直径90mm.3.11pH计或精密pH试纸.3.12微量离心管：1.5mL或2.0mL.3.13接种环：1μL. 3.14低温高速离心机：转速≥13000r/min，控温4℃~8℃，3.15微生物鉴定系统.3.16 PCR仪.3.17微量移液器及吸头：0.5μL~2μL，2μ1~20μL.20μL~200μL，200μL~1 000pL.3.18水平电泳仪：包括电源、电泳槽、制胶槽（长度>10cm）和梳子. 3.198联排管和8联排盖（平盖/凸盖）.3.20凝胶成像仪.
4培养基和试剂
4.1营养肉汤：见A.1.4.2肠道菌增菌肉汤：见A.2.4.3麦康凯琼脂（MAC）：见A.3.4.5三糖铁（TSI）琼脂：见A.5. 4.4伊红美蓝琼脂（EMB）：见A.4.4.6蛋白陈水、靛基质试剂：见A.64.7半固体琼脂：见A.7.4.9氰化钾（KCN）培养基：见A.9. 4.8尿素琼脂（pH7.2）：见A.8.4.10氧化酶试剂：见A.104.11革兰氏染色液：见A.11.4.12BH1肉汤：见A.12.4.13福尔马林（含38%~40%甲醛）. 4.14鉴定试剂盒.4.15大肠埃希氏菌诊断血清.4.16 灭菌去离子水，4.170.85%灭菌生理盐水.4.18TE(pH8.0):见A.13. 4.1910×PCR反应缓冲液：见A.14.4.20 25 mmol/L MgCl .4.21dNTPs:dATP、dTTP、dGTP、dCTP每种浓度为 2.5 mmol/L.4.22 5 U/L Taq 酶. 4.23引物4.2450×TAE电泳缓冲液：见A.15.4.25琼脂糖.
