中华人民共和国国家标准
GB 5413.20-2022
食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定
中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准代替GB5413.20-2013《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定》.本标准与GB5413.20-2013相比，主要变化如下： 一副除了第二法雷氏盐分光光度法，增加了离子色谱法作为第二法：一增加了液相色谱-串联质谱法作为第三法.
食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定
1范围
本标准规定了要幼儿食品和乳品中胆碱的测定方法.本标准适用于要幼儿食品和乳品中胆碱的测定.
第一法酶比色法
2原理
试样经酸水解，再经酶作用后与显色剂反应生成有色物质，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与胆碱含量成正比，外标法定量.
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水.
3.1试剂
3.1.1三羟甲基氨基甲烷[（CHOH）CNH：].3.1.2苯酚（CH;OH）.3.1.3浓盐酸（HCI).3.1.4氢氧化钠（NaOH）.3.1.5胆碱氧化酶：≥10U/mg，置于-20℃C保存. 3.1.6过氧化物酶：≥250U/mg，置于2℃C~8C保存.3.1.74-氨基安替比林（CHNO）.3.1.8磷脂酶D：≥60U/mg，置于-20C保存.
3.2试剂配制
3.2.1盐酸溶液（1 mol/L)：量取85mL浓盐酸注入约 900mL水中，稀释至1 000 mL.3.2.2盐酸溶液（3mol/L）：量取250mL浓盐酸注人约600mL水中，稀释至1000mL.3.2.3三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液（Tris）（0.05mol/L）：准确称取6.057g三羟甲基氨基甲烷溶于500mL水中，用盐酸溶液（1mol/L）调pH至8.0±0.2.再用水定容至1000mL.此溶液在4℃C冰箱中可保存1个月.3.2.4显色剂：取120U的胆碱氧化酶、280U的过氧化物酶、100U的磷脂酶D、15mg4-氨基安替比 林和50mg苯酚置于100mL的容量瓶中，用0.05mol/LTris缓冲溶液溶解并定容.临用现配.3.2.5氢氧化钠溶液（500g/L）：称取500g氢氧化钠，溶于水并稀释至1000mL，采用塑料容器储存.
3.3标准品
家认证并授于标准物质证书的标准物质. 胆碱酒石酸氢盐标准品（CHNO，相对分子质量：253.25，CAS号：87-67-2）：纯度≥99%，或经国
3.4标准溶液配制
3.4.1胆碱（以胆碱氢氧化物计，相对分子质量121.18）标准储备溶液（2500mg/L）：准确称取在102℃士2℃烘至恒重的胆碱酒石酸氢盐522.5mg.用水溶解并转移至100mL容量瓶中定容，混匀. 4℃以下避光保存，有效期3个月.
3.4.2胆碱标准工作溶液（250mg/L)：吸取10.0mL胆碱标准储备溶液于100mL容量瓶中，用水定容，混匀，4℃以下避光保存，有效期1个月，
3.5材料
3.5.10.45pμm水性滤膜针头滤器.3.5.2注射器：5mL或相当者.
4仪器和设备
4.1分析天平：感量分别为0.1mg和0.001g.4.2恒温水浴装置：温度可控制在70C土2℃和37C土2℃4.4分光光度计. 4.3pH计：精度0.01.
5分析步骤
5.1样品前处理
5.1.1样品预处理
准确称取20g（精确至0.001g）混合均匀的液态试样于100mL锥形瓶中，加入3mol/L的盐酸溶液10mL，加塞混匀.
准确称取5g（精确至0.001g）混合均匀的半固态或固态试样于100mL锥形瓶中，加人1mol/L的盐酸溶液30mL，加塞混匀.
5.1.2水解
将装有试样的容器放在70℃土2C水浴中，放置3h（每隔30min振据一次），冷却至室温，用氢氧化钠溶液（500g/L）调pH至3.5~4.0，转人50mL容量瓶中，用水定容至刻度.
5.1.3过滤
用滤纸过滤水解液，若滤液不澄清，用0.45μm水性滤膜针头滤器再次过滤.收集滤液待测.
5.2测定
5.2.1标准曲线的制作
分别吸取 2.00 mL、4.00mL、6.00mL、8.00 mL、10.00mL胆碱标准工作溶液（250mg/L)于10 mL
的容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，配制成浓度分别为50.0mg/L、100mg/L、150mg/L.200mg/L、250mg/L的标准系列工作溶液.准备6支比色管，一个比色管用作试剂空白（A），加人100μL水，另37℃±2C水溶中保温反应15min. 5支比色管对应加人标准系列工作溶液各100μL，再分别加人3.00mL显色剂，混匀，把比色管置于
5.2.2试样准备
准备2支比色管（B，C），均加人待分析溶液100pL，比色管B加人3.00mL水，比色管C加入3.00mL显色剂，混匀，把比色管置于37C±2C水浴中保温反应15min.
5.2.3比色测定
将标准系列工作溶液及试样从水浴中取出，冷却至室温，在波长505nm处，用水作空白，用1cm微量比色Ⅲ测定吸光值.以胆碱标准溶液的浓度为横坐标，以标准溶液的吸光值减去试剂空白（比色管A)的吸光值为纵坐标，制作标准曲线.
6分析结果的表述
6.1净吸光值的计算
通常配制的试剂会产生轻微颜色，且由于水解作用滤液也不是无色的，为了除去这些干扰因素，必须从总吸光值中减去各自的空白值（比色管A和比色管B）.
试样净吸光值按式（1）计算：
式中：
A-试样净吸光值； A一一总吸光值（比色管C））；A-试剂吸光值（比色管A）；A.一一滤液吸光值（比色管B）.A和A.不应大于总吸光值的20%.
6.2胆碱含量的计算
试样中的胆碱（以胆碱氢氧化物计）的含量按式（2）计算：
*( 2)
式中：
X 试样中的胆碱（以胆碱氢氧化物计）含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；C 自标准曲线上查得净吸光值对应的胆碱的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V 一水解液被稀释的体积（水解液定容体积，通常为50mL），单位为毫升（mL）；f 100换算系数； 稀释倍数；1000-换算系数.计算结果保留三位有效数字.
m一试样的质量，单位为克（g）；
