中华人民共和国国家标准
GB 5009.222-2026
中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准代替GB5009.222-2016（食品安全国家标准食品中枯青霉素的测定》.本标准与GB5009.222-2016相比，主要变化如下：一将原标准第一法免疫亲和柱净化-高效液相色谱法和第二法C固相萃取小柱净化-高效液相 修改了标准的适用范围：色谱法合并为第一法液相色谱法；一增加了液相色谱-质谐/质谱法为第二法.
食品安全国家标准
食品中桔青霉素的测定
1范围
本标准规定了食品中桔青霉素的测定方法.第一法液相色谱法和第二法液相色谱-质谱/质谱法适用于食品中枯青霉素的测定.
第一法液相色谱法
2原理
试样经甲醇-水提取，免疫亲和柱或C固相萃取柱净化，液相色谱-荧光检测器检测，外标法定量.
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
3.1试剂
3.1.1乙晴（CHCN）：色谱纯.3.1.2乙晴（CHCN）.3.1.3磷酸（HPO4）：色谱纯.3.1.4丙三醇（CH，O）.3.1.5甲醇（CHOH） 3.1.6盐酸（HCI).3.1.7氢氧化钠（NaOH）.3.1.8氯化钠（NaCl）.3.1.9磷酸氢二钠（NaHPO）.3.1.10磷酸二氢钾（KHPO）.3.1.12吐温-20（CHO） 3.1.11氯化钾（KCI）.
3.2试剂配制
3.2.10.1%磷酸溶液：吸取1.0mL磷酸，加水稀释至1000mL，混匀.3.2.2乙晴-水（2080）：量取20ml乙晴和80mL水，混匀.3.2.410%丙三醇甲醇溶液：称取1.0g丙三醇，用甲醇稀释至10mL，混匀. 3.2.3甲醇-水（7030）：量取700mL甲醇和300mL水，混匀.
GB 5009.222-2026
3.2.5磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用980mL水溶解后，盐酸调pH值至7.2~7.6.再加水至1000mL，混匀.3.2.6含0.5%吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBS-T）：称取5g吐温-20，加人PBS稀释至1000mL 混匀.
3.3标准品
3.3.1桔青霉素（C，H，O;，CAS号：518-75-2）：纯度≥99%的标准品或其溶液.
3.4标准溶波配制
3.4.1标准储备溶液（100mg/L)：称取桔青霉素10.0mg（精确至0.1mg）至小烧杯中，加乙晴溶解，转移至100mL容量瓶中，以乙晴定容至刻度，混匀，得到质量浓度为100mg/L的标准储备溶液.将溶液转移至棕色试剂瓶中，于一18℃及以下温度避光保存，有效期12个月.3.4.2标准中间溶液（10.0mg/L）：准确吸取1.00mL.标准储备溶液至10.0mL容量瓶中，加乙晴稀 释，定容至刻度，混匀，得到质量浓度为10.0mg/1的标准中间溶液.将溶液转移至棕色试剂瓶中，于一18℃及以下温度避光保存，有效期12个月.3.4.3标准工作溶液（1.00mg/L)：准确吸取1.00mL标准中间溶液至10.0mL容量瓶中，加乙睛稀释，定容至刻度，混匀，得到质量浓度为1.00mg/L的标准工作溶液.将溶液转移至棕色试剂瓶中，在2C~6℃下避光保存，有效期3个月，3.4.4标准系列工作溶液：准确移取标准工作溶液适量，用乙晴-水（2080）配制成质量浓度分别为 1.00μg/L、2.00μg/L、5.00μg/L、20.0μg/L、100μg/L的标准系列工作溶液.临用现配.
3.5材料
3.5.1免疫亲和柱：柱容量≥150ng，柱回收率≥85%.3.5.2C固相萃取柱（1g/6mL），或相当者.3.5.4微孔滤膜：0.45μm，有机系. 3.5.3玻璃纤维滤纸.
4仪器和设备
4.2电子天平：感量分别为0.01g、0.001g和0.1mg. 4.1液相色谱仪：配有荧光检测器.4.3离心机：转速≥6000r/min4.4振荡器：转速≥1000r/min4.5涡旋混合器.4.6高速粉碎机.4.7组织接碎机. 4.8固相萃取装置.4.9高速匀浆机.4.10超声波清洗器：功率不小于250W
5分析步骤
5.1试样制备与保存
5.1.1试样制备
检测用的样品量应大于1kg；当样品量不足1kg时，至少取同一批次的3个包装；缩分后取不低于0.5kg.其中，固体样品用高速粉碎机粉碎，半固体样品用组织搞碎机捣碎，液体样品用匀浆机匀浆.
注1：对于高油脂含量额粒样品、柔韧性样品、高黏度样品、高糖样品等特殊样品可采取冷冻等措施进行制样.注2：对于碳酸饮料或酒类等：可采取超声、搅拌或抽真空等措施脱气后混匀. 注3：根据检验目的可按实际情况取样钢备.
5.1.2试样保存
制备后混合均匀的样品均分至约100g的多个包装，储存于活净的容器内，密封后根据样品性质置于2℃~6℃或一18℃及以下避光保存.
5.2试样提取
5.2.1固体、半固体试样（红曲类除外）
称取试样5g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加人25mL甲醇-水（7030），振荡（或超声）提取30min，于6000r/min或更高转速下离心5min，上清液待净化，
5.2.2固体、半固体红曲类试样
取30min，于6000r/min或更高转速下离心5min，上清液待净化.
5.2.3液体试样
称取试样5g（精确至0.01g）于25mL容量瓶中，加水定容至刻度，再转移到50mL离心管中，振荡提取30min，于6000r/min或更高转速下离心5min，上清液待净化.
5.3试样净化
5.3.1免疫亲和柱净化
吸取1.00mL提取液，加PBS-T稀释至20mL，混匀（如有浑浊，用玻璃纤维滤纸过滤或高速离心后再上柱），待免疫亲和柱恢复至室温后，将样品稀释液过免疫亲和柱，流速控制在1mL/min～3mL/min，待上样完毕，依次用10mLPBS-T、10mLPBS溶液淋洗免疫亲和柱，抽干，2mL甲醇洗脱（控制流速约为1mL/min），抽干，收集洗脱液，加人50μL10%丙三醇甲醇溶液，40℃下氮气吹干，加入1.00mL乙晴-水（2080）复溶，涡旋振荡30s，过微孔滤膜于进样瓶中，待测.
注：由于不同厂商提供的免疫亲和柱操作程序可能不同，实际操作时，请参照厂商提供的操作说明和程序使用.
5.3.2C固相萃取柱净化（仅适用于谷物及其制品试样）
C固相萃取柱在使用前依次用6mL甲醇、6mL水活化.
吸取1.00mL提取液，用水稀释至20mL，混匀（如有浑浊，用玻聘纤维滤纸过滤或高速离心后再上
