中华人民共和国粮食行业标准
LS/T6132-2018
粮油检验 储粮真菌的检测 孢子计数法
Inspection ofgrain and oilsStoragefungal examination-Enumeration sporesoffungi
国家粮食局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由国家粮食局提出.
本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAC/TC270）归口.
本标准起草单位：国家粮食局科学研究院、国家粮食局标准质量中心、湖北省粮油食品质量监测站、河南省粮油饲料产品质量监督检验站、安徽省粮油产品质量监督检测站、山东省粮油检测中心.
本标准主要起草人：唐芳、程树峰、朱之光、曹阳、欧阳毅、张海洋、祁智慧、熊宁、尹成华、季一顺、姜洪、李琦、胡斌、胡纪鹏、尹豪.
粮油检验储粮真菌的检测 孢子计数法
1范围
本标准规定了粮食储藏过程中生长真菌的检测方法.
本标准适用于小麦、稻谷、玉米和大豆原粮储存过程中可生长真菌的检测.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T29890粮油储藏技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
储粮真菌storagefungi
粮食储藏过程中，籽粒上生长的真菌，主要是霉菌，其中曲霉和青霉危害严重.储藏初期对粮食造成危害的主要是灰绿曲霉和白曲霉.
3.2
储粮真菌分生孢子conidiosporeofstoragefungi
储粮真菌生长繁殖过程中，会产生一种生于细胞外的无性孢子，称之为分生孢子.分生孢子因真菌种类而有差异，是真菌鉴定的依据之一.
3.3
灰绿曲霉AspergillusglaucusG.
粮食上常见曲霉，是粮食储藏期间初期侵染粮粒的重要霉菌.具有干生性的特点，能在高渗透压的基质上旺盛发育，孢子萌发的最低相对湿度在65%～80%.因其生长对温度的要求不高，能侵害低水分含量（14.5%以下）粮食，可以侵人和杀死种胚，使粮食丧失发芽力和变色，导致粮食变质.
白曲霉Aspergillus candidus
陈粮中常见曲霉，腐生性强，是导致粮食霉变发热的主要危害霉菌.中温性和干生性，孢子萌发最低相对湿度75%左右，主要侵染水分含量为15.0%左右的谷物，会引起发芽率下降和粮食霉变.
4原理
储粮真菌会产生一定数量的分生孢子.用水将试样中的孢子洗脱下来，在规定条件下，通过显微镜计数，检测孢子的数量.孢子的数量反映了储粮生霉的状况，是粮食储藏安全的重要指标.
LS/T6132-2018
5试剂和仪器
5.1天平：感量0.1g.
生物显微镜：目镜10×，物镜10×～60×.5.2
5.3 血球计数板：规格为25个中方格，V等于0.1mm3，计数板结构参见A.1.
5.4 盖玻片：20mm×20mm.
5.5 具塞试管：50mL.
5.7 计数器：计数范围为0~9999.转动式回零.
5.8 胶头滴管：长度大于200 mm.
实验用水：符合GB/T6682国家实验室三级水标准，检测前需在显微镜下镜检，确认实验用水显5.9微镜视野无杂物干扰即可使用.
6扦样
按照GB/T29890的扦样要求托取根食样品需单独存放，每份样品200g，于自封袋密封保存.样品在保存和运输的过程中，应采取必要的措施防止样品中原有微生物发生数量变化，保持样品的原有状态.
7操作步骤
7.1 孢子洗脱
称样前将样品混合均匀，准确称取10.0g原始样品于具塞试管（5.5）中，加人30mL水（5.9），加塞，上下剧烈振荡1min振荡频率为每分钟120次150次，用300目滤布（5.6）过滤，收集滤液于具塞试管中（5.5）备用.
7.2孢子计数
7.2.1血球计数板准备：加样前，对血球计数板（5.3）计数室进行镜检，若有污物，需清洗吹干后使用.7.2.2点样品：在计数板（7.21)计数室上加盖一块盖玻片（5.4).将71中制备的滤液振荡摇匀，立即用滴管（5.8）吸取少许，从计数室最外侧沿盖玻片下边缘滴人一小滴（不宜过多）（参见A.3），让滤液一次性虹吸充满计数室，防止产生气泡.充人滤液的量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜（参见A.4）.
7.2.3计数：点样后静置30s，使真菌孢子沉降到计数板上，不随液体漂移.将计数板放置于显微镜（5.2）的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数.计数方法参见图A.2和图A.5.当5个中方格中孢子数量少于10个时，需计25个中方格的孢子数.
7.2.4计数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度.洗净干燥后，放入盒内保存.
7.2.5初期危害真菌的孢子显微形态：灰绿曲霉分生孢子椭圆形至亚球形，直径一般为2um～6um表面粗糙有刺；白曲霉分生孢子球形至亚球形，直径一般为2.5μm～3.5μm，表面光滑.分生孢子显微形态图片参见附录B.
8结果计算
计5个中方格孢子数时按式（1）计算，计25个中方格孢子数时按式（2）计算，计算结果保留到小数点后1位数字.
X=（A×10）×（30/10)=30000A
式中：
X- 每克粮食样品中孢子总数，单位为个每克（
A -5个（或25个）中方格内孢子总数，单位为个（个）.
检测报告
9.1同一样品进行两次平行计数，检测结果以两次计数结果最大值记录.
9.2根据计算结果出具报告.
注：可根据孢子计数结果对储粮安全性进行初步判定：判定方法参见附录C.
