中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4525.1-2016
出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法 第1部分：沙门氏菌
Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export foodPart1:Salmonella
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型MLST方法》共分10个部分：
本部分为SN/T4525的第1部分
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本部分起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局.
本部分主要起草人：林燕奎、刘慧玲、袁芳、吕敬章、马淑棉、黄欣迪、葛丽雅、黄李华、赵芳、国燕云、蒋原、薛峰.
MLST方法第1部分：沙门氏菌 出口食品中致病菌的分子分型
1范围
本部分适用于出口食品中沙门氏菌的分子分
SN/T4525的本部分规定了出口食品中沙门氏菌分子分型ML.ST检测方法.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
3.1.1 下列术语和定义适用于本文件
管家基因house-keeping genes
细胞中均要表达的一类基因，其产 产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达. 仅称看家基因，持家基因.
3.1.2
Taq DNAThermus aquaticus DNA polymerase
从Thermus aqaaticus细菌中提取的耐热 DNA聚合酶.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）EDTA，乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)MLST：多位点序列分型（multilocus sequence typing）
ST：序列型（Sequence Type)Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane]
4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编
SN/T 4525.1-2016
号，不同的菌株对应不同的序列型，从面揭示菌株间等位基因的多样性，MILST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性.
5试剂和材料
除有特殊说明外.实验用试剂均为分析纯或生化试剂：实验用水符合GB/T6682中一级水的
要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.5.1DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒.5.2Taq DNA 酶. 5.3 dNTP;dATP dTTP dCTP dGTP.5.4引物：扩增引物和测序引物序列见表A.2.5.510×PCR缓冲液：200mmol/L.Tris-HCl(pH8.4).200mmol/L氯化钾.15mmol/L氯化镁.5.6琼脂糖凝胶. 5.7Gelred核酸染色剂.5.86×溴酚蓝上样缓冲液.5.9分子量标记：100bpDNAmarker.5.10 5×TBE 电泳缓冲液：445 mmol/L Tris，445 mmol/L 硼酸，10 mmol/1. EDTA(pH 8.0).使用5.11质控菌株：肠炎沙门氏菌ATCC13076或等效菌株. 时稀释为0.5×TBE电泳缓冲液.
6仪器和设备
6.1离心机.6.3pH计.6.4涡旋探荡器.6.6电泳仪， 6.7凝胶成像仅，6.8基因测序仅.6.9超净工作台.6.10移液器；0.1μL~2.5μL、2pl~20pL、20μl~200pl、100μL~1000pl
6.2天平：量程2kg-感量0.1g.
6.5PCR仪.
7检测程序
PCR扩增，再进行PCR产物的纯化和DNA序列双向测定，将所得到的沙门氏菌7个管家基因测序结 根据沙门氏菌的7个管家基因，设计PCR引物和测序引物序列（见附录A），通过管家基因片段的果的上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的几个碱基不计算人序列测定结果.最后将测序结果上传至ML.ST网站（
MLST的操作程序见图1.
图1MLST操作程序
8检测步骤
8.1细菌基因组DNA提取
将经过GB4789.4的方法鉴定为沙门氏菌的菌株提取基因组DNA.
8.2MLST基因选择
按表A.1所示选择沙门氏菌的7个管家基因进行MLST分析
8.3PCR扩增引物和测序引物的选择
在使用前按照相应分子量进行稀释到10μmol/L，一20C保存备用. 按表A.2中的序列，合成沙门氏菌7个管家基因对应的7对PCR扩增引物和7对测序引物.引物
8.4管家基因片段的PCR扩增
反应体系体积为50μl:10×PCR缓冲液5μl、dNTP（2.5mmol/L）4pl、引物对（10μmol/L)2pL、Taq DNA 聚合酶（5 U/L）0.4μL、模版DNA 2μL、水34.6pL.
