中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4525.6-2016
出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法 第6部分：化脓链球菌
Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export foodPart 6:Streptococcus pyogenes
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型MLST方法》共分10个部分：
一第1部分：沙门氏菌；第3部分：副溶血性弧菌： 一第2部分：金黄色葡萄球菌；第4部分：霍乱弧菌；一第5部分：克罗诺杆菌：第6部分：化脓链球菌：第7部分：空肠弯曲菌； 第8部分：致泻性大肠埃希氏菌；-第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌：第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌.本部分为SN/T4525的第6部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本部分起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局.本部分主要起草人：蒋鲁岩、王毅谦、袁芳、封振、薛峰、肖震、倪鹏、邵景东、曾德新.
出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法 第6部分：化脓链球菌
1范围
SN/T4525的本部分规定了检遇出口食品中化链球菌的分子分型MLST法.本部分适用于出口食品中化脓髓球菌的分子分型检测
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB4789.11食品安全国家标准食品微生物学检验型溶血性链球菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GB19489实验室生物安全通用要求
3定义、术语和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1.1
管家基因house-keeping genes
细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达.又称看家基因，持家基因.
3.1.2
Taq DNA 高Thermus aquaricus DNA polymerase
从Thermms aquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）EDTA;乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)MLST；多位点序列分型（multilocus sequence typing）Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl)aminomethane]
ST：序列型（SequenceType)
4原理
号，不同的菌株对应不同的序列型，从面揭示菌株间等位基因的多样性.MLST分型中多个管家基因 MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性.
5试剂和材料
除有特殊说明外，实验用试剂均为分析纯：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求.5.1 DNA 提取液:50 mmol/IL Tris-HCI(pH8.0) 100 mmol/L EDTA(pH 8.0) 100 mmol/L NaCl 试剂均用无DNA酶污染的容器分装.1%SDS 5.2酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）.5.3异丙醇， 5.475%乙醇.5.5TE溶液(pH8.0):10 mmol/L Tris-HCI(pH8.0)，1 mmol/L EDTA(pH8.0)，高压灭菌.5.6 Tag DNA酶.5.7dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP 5.8引物：扩增引物和测序引物序列见表A.2.5.910×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HC1(pH 8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氧化镁.5.102%琼脂糖凝胶.5.11EB核酸染色剂. 5.12分子量标记：100bp~2000bpDNAmarker.5.135×TBE电泳缓冲液：445mmol/LTris，445mmol/L硼酸，10mmol/LEDTA（pH8.0）.使用时稀释为0.5×TBE电泳缓冲液.5.14质控菌株：化脓链球菌Streptococcuspyogenes M1 GAS或等效菌株.
6仪器和设备
6.1离心机.6.3pH计.6.5PCR仪. 6.6电泳仪.6.7凝胶成像仪.6.8基因测序仪.6.9超净工作台. 6.10移液器：0.1μL~2.5pL、2μL~20μL、20L~200pL、100μL~1000μL
6.2天平：量程2kg.感量0.1g.
6.4涡旋振荡器.
7操作流程
多位点序列分子分型操作流程见图1.2
图1多位点序列分型（MLST）操作步骤
8操作步骤
8.1细菌基因组DNA提取
将经过GB4789.11的方法进行鉴定为化链球菌的菌株提取基因组DNA.取待测样本1mL，加到1.5mL离心管中.8000r/min离心3min，弃去上清.加人750pLDNA提取液，65C温浴30min，加酯：三氯甲烷异戊醇（25：24：1）500μL，振荡混匀，13000r/min离心5min，吸取500L上清液与400μL的异丙醇充分混合，13000r/min离心5min，75%乙醇冲洗沉淀一次，13000r/min离心5min，弃去上清，沉淀干燥后溶于30uLTE溶液中，立即用于检测或短期保存于-20℃，
注：意可使用其他经验证的DNA提取方法或等效的商品化细菌DNA提取试剂盒，按照其使用说明操作.
8.2DNA浓度和纯度的测定
和280nm处的吸光值A和Aso，DNA的浓度按式（1）计算： 取5μL.DNA溶液加双蒸水稀释至1ml，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm
式中：
A-260nm处的吸光值； DNA浓度，单位为微克每微升（xg/μL）：
