中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4781-2017
出口食品和饲料中产志贺毒素大肠 埃希氏菌检测方法实时荧光PCR法
Detection of Shiga toxin-producingEscherichia coli in food andanimal feed for exports-Real-timePCRmethod
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
疫局. 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检
本标准主要起草人：邵景东、申进玲、封振、王传现、薛峰、郭肠、吴福平、王毅谦、李晓红、祝长青、肖震、崔思宇.
出口食品和饲料中产志贺毒素大肠 埃希氏菌检测方法实时荧光PCR法
1范围
本标准规定了出口食品和饲料中产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光PCR快速检测方法.
0103）的检测. 本标准适用于出口食品和饲料中产志贺毒素大肠埃希氏 （O157、O104、0111、026、0145和
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是 必不可少的. 比是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分于生物学检测
GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
产志贺毒素大肠埃希氏菌Shiga toxin-producingEscherichin coli;STEC 含有志贺毒素编码基因x的大肠埃希氏菌.
3.1
3.2
肠出血性大肠埃希氏菌 Shiga toxin-producing Escherichia coli causing the attaching andeffacing lesion
同时含有志贺毒素编码基因stx和紧密素编码基因eae的大肠埃希氏菌.
注：这种毒力基因组合常与STEC所引起的严重疾病相关.
3.3
实时荧光PCRreal timePCR
在PCR反应体系中加人荧光集团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程.
3.4
Ct值cycle threshold
每个反应管内荧光信号达到设定阔值时所经历的循环数.
4方法提要
对样品中微生物进行增菌培养后提取核酸，采用实时荧光PCR方法对志贺毒素编码基因stx和紧密素编码基因eae进行检测.若样品中str阳性，继续进行菌株分离：若stx和eae阳性，继续进行O血
SN/T 4781-2017
清组编码基因rfbE（O157）、wzx（O104）、wbd（O111）、wzx（O26）、ihp1（O145）和wzx（O103）的检测.若检测到以上某种O血清组阳性，可先对特异的O血清组菌株富集再进行菌株分离.
5培养基和试剂
除有特殊说明外，实验用试剂均为分析纯：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求.
试剂均用无DNA酶污染的容器分装.5.1改良胰蛋白陈大豆肉汤（mTSB）：见附录A中A.1.5.2缓冲蛋白陈水（BPW）：见A.2.5.3CHROMagar STEC显色培养基：见A.3.5.4CHROMagarO157显色培养基：见A.4. 5.5改良山梨醇麦康凯（CT-SMAC）琼脂：见A.55.6三糖铁琼脂（TSI）：见A.6.5.7TE溶液.5.810%SDS.5.9蛋白酶K（20mg/mL）.5.10氯化钠（NaCl);5mol/L和0.7mol/L. 5.1110%CTAB5.12三氯甲烷.5.13异戊醇.5.14异丙醇.5.1570%乙醇.5.17PCR预混液. 5.16核酸提取试剂盒.5.18引物和探针：见附录B5.19诊断分型血清：O157、O104、O111、O26、O145和O103混合多价或单因子血清.5.20API20E生化鉴定试剂条或同类产品.5.21GNI卡或同类产品.5.22标记单抗磁珠：抗一0157/0104/0111/026/O145/O103免疫磁珠试剂或同类产品.
6仪器和设备
6.1恒温水浴或加热套装置：100℃6.2恒温培养箱：36C±1℃.6.4天平：量程2kg，感量0.1g. 6.3离心机：最大转速13000r/min以上.6.5低温冰箱：-20℃~4℃.6.6均质器.6.7涂布棒：直径3mm~4mm.6.8接种环：直径3mm.6.9灭菌样品处理器具：取样勺、剪刀、镊子.
6.11实时PCR反应管（0.2/0.5mL），多孔PCR微孔板. 6.10可调移液器：1pL~1000pl6.12荧光PCR仪.6.13全自动细菌鉴定系统（VITEK或同类仪器）.6.14显微镜.6.15磁极和混匀器.
7检验程序
STEC检验程序见图1.
图1产志贺毒素大肠埃希氏菌检验程序
8操作步骤
8.1样品处理
冷冻样品应在45C以下不超过15min或在2℃~5℃解冻不超过18h解冻：若不能及时检验，应置于-10℃~-20℃保存.非冷冻的易腐样品若不能及时检验，应置于2℃~5C冰箱保存，在24h内检验.
