中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4814-2017
进出口食用动物四环素类药物残留量 的测定液相色谱-质谱/质谱法
Determination of the tetracyclinemedicine residuse of liveanimals forimport and export-LC-MS-MSmethod
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：张勋、孟日增、赵榴慧、石建平、康明芹、王明泰、马书民、吴连鹏、刘韬、胡婷婷、杨帆、邢燕燕.
进出口食用动物四环素类药物残留量 的测定液相色谱-质谱/质谱法
1范围
本标准规定了进出口食用动物中四环素类药物残留量的液相色谱-质谱/质谱检测方法，
霉素4种四环素类抗生素残留量. 本标准适用于测定食用动物猪、牛、羊的尿液和血液，鸡的血液中的四环素、金霉素、土霉素和强力
2规范性引用文件
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法提要
试样用0.1mol/LNaEDTA-Mcllvaine缓冲液（pH=4.0±0.05）提取，经过滤和离心后，上清液用HLB固相萃取柱净化，用1mL甲醇定容，供液相色谱-质谐/质谱仪测定和确证，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2乙酸乙酯：色谱纯4.3乙二胺四乙酸二钠（NaEDTA2HO）. 4.4甲酸：色谱纯.4.5柠橡酸（CHOHO）.4.6磷酸氢二钠（NaHPO.12HO）.4.7柠橡酸溶液：0.1mol/1.称取21.01g柠檬酸（4.5）.用水溶解，定容至1000mL. 4.8磷酸氢二钠溶液：0.2mol/L.称取28.41g磷酸氢二钠（4.6），用水溶解，定容至1000ml.4.9Mellvaine缓冲溶液：将1000mL0.1mol/L.柠檬酸溶液（4.7）与625mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（4.8）混合.用10mol/L氢氧化纳调节pH=4.0±0.05.4.10NaEDTA-Mcllvaine缓冲溶液：0.1mol/L.称取60.5g乙二胺四乙酸二钠（4.3）放人1625mLMcllvaine缓冲溶液（4.9）中，超声使其溶解，摇匀. 4.11甲醇水（119）：量取5mL甲醇（4.1）与95mL水混合.4.12甲醇乙酸乙酯（19）：量取10mL甲醇（4.1）与90mL乙酸乙酯（4.2）混合.4.13OasisHLB固相萃取柱：60mg，3mL，或相当者，使用前分别用5mL甲醇，5mL水和5mLNaEDTA-Mcllvaine缓冲溶液预处理，并保持柱体湿润.
4.14标准物质：四环素，金霉素，土霉素，强力霉素，纯度≥95%.
SN/T 4814-2017
4.15标准储备溶液：准确称取按其纯度折算为100%质量的四环素，金霉素，土霉素，强力霉素各20.0mg，分别用甲醇溶解并定容至100mL，浓度相当于200mg/L，储备液在-18C以下储存于棕色瓶中，可12个月，
4.16混合标准工作液：根据需要，用甲醇（4.1）将标准储备溶液配制成1.0μg/mL的混合标准工作溶液.混合标准工作溶液应使用前配置.
4.17滤膜：0.22pm，有机相与水相两用.
5仪器
5.1液相色谱串联质谐仪：配有电喷雾离子源（
5.2分析天平：感量0.1mg.0.01g.
5.3旋涡混合器.
5.4低温离心机：10000r/min，控温地围为一10C至室
5.6固相萃取真空装置. 5.5氮吹浓缩仪，5.7pH计：测量精度土0.02.
5.8超声提取仪.
6样品制备与保存
期保存需置于4℃下.
6.2食用动物（猪、牛、羊和鸡）血液：全血凝固后取上层血清，避免溶血，若有溶血，可离心后取上清.长期保存需置于4C下
6.3在制样和保存的操作过程中，应防止样品受到污染.
7测定步骤
7.1提取
NaEDTA-Mellvaine缓冲溶液（4.10）定容至50mL，混匀，用滤纸过滤，待净化.
7.2净化
用移液器准确吸取10mL提取液（相当于1g样品）以1滴/s的速度过HLB固相萃取柱（4.13），待样液完全流出后，依次用5mL水和5mL甲醇水（4.11）淋洗，弃去全部流出液.2.0kPa以下减压抽 干5min，最后用10mL甲醇乙酸乙酯（4.12）洗脱.将洗脱液吹氮浓缩至干（温度低于40C），用1.0mL甲醇定容，过0.22μm滤膜（4.17），待测定.
7.3标准曲线的绘制
0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL标准工作溶液，用液相色谱串联质谱仪测定，得出标准工作曲线. 移取混合标准工作液（4.16），用甲醇稀释成0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.05pg/ml、0.1μg/mL、
7.4测定
7.4.1液相色谱条件
液相色谱条件：
a）色谱柱：C柱，150mm×2.0mm（内径），粒径3μmb）流动相：甲醇-0.1%甲酸水，梯度洗脱时间表见表1： c）流速：250μL/min；d）柱温：30℃；e）进样量：10pμL.
表1分离4种四环素类药物的液相色谱洗脱梯度
时间/min 甲醇 0.1%甲酸水0 6 7010 5 33.5 30 66 512 65 3517 5 65 3520 9525 95
7.4.2质谱条件
离子化模式：电喷雾电离正离子（ESI）：质谱扫描方式 多反应监测（MRM）：分辨率：单位分辨率：其他参考质谱条件参见附录A.
7.4.3定性测定
7.4.3.1保留时间
待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在士2.5%之内，各种四环素类药物的参考保留时间如下：四环素12.58min、金霉素16.86min、土霉素13.00min、强力霉素18.39min.标准溶液的色讲围参见附录B的图B.1.
7.4.3.2信噪比
待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于或等于3（S/N≥3），定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于或等于10（S/N≥10）.
7.4.3.3定量离子、定性离子及子离子率度比
每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，面且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表2规定的范围.
