中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4849.6-2017
出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法实时荧光PCR法 第6部分：猕猴桃
Identification of the ingredients of mon small berry fruitsin food and juice for export-Real-timePCRmethodPart 6:Kiwi
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4849（出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法》系列标准共分为6部分：
--第1部分：蓝莓：第3部分：黑加仑； 第2部分：树莓；第4部分：桑客；第5部分：蔓越莓和蓝莓；一第6部分：称机.
本部分为SN/T4849的第6部分. 本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本部分由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院.本部分主要起草人：陈颖、邓婷婷、黄文胜、吴亚君、杨艳歌、刘鸣畅、韩建助、张九凯、王斌.
出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法实时荧光PCR法
第6部分：猕猴桃
1范围
SN/T4849的本部分规定了出申食品及饮料中擦颗桃成分的检测方法实时荧光PCR法，
食品及饮料中猕震桃成分的定性检测（清汁及果酒除外）.本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为 本部分适用于鲜果、冷冻果、蜜钱、鲜榨果汁、果肉型果汁、果干、果酱等以淤猴桃为原辅料的初加工1%（体积比）.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注目期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件3.1.1
小浆果small berryfruits
浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔教多汁的肉质单集，由一个或几个心皮形成.小浆果则泛指果实较小、多汁的一类蒙果3.1.2
猕桃kiwi
藤黄目猕猴桃科猕察桃属植物果实，果形一般为椭圆状，内部为绿色（或红色）果肉和一排黑色或者红色的种子，拉丁文名：ActinidiaChinensis.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）. PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction).Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate）.dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate）.dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）.
SN/T 4849.6-2017
dGTP：脱氧乌苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate）.dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate）.UNG：尿喀啶N-糖基化酶（uracil N-glycosylase).CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammoniumbromide）.EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid）. Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethyl）aminomethane].Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticus）.OD：光度密度（opticaldensity）.
4方法提要
果实样品直接粉碎离心，果汁样品直接离心，提取沉淀DNA，果干、果酱、蜜饯先用蒸馏水清洗再提取DNA.以猕桃果实为阳性对照，以其他水果DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照.使用特异性引物探针进行实时荧光PCR扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在猕猴桃成分.
5试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.
5.1检测用引物和探针：猕猴机成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表1.称猴桃引物扩增的靶标序列参见附录A
表1猕猴桃序列引物探针
物种名称 引物/探针序列（5→3） 扩增片 杞基因F GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA 段长度内参照 R;AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA 138 bp NADH dehydrogenaseP;FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1 subunit B( mdhB) geneF:GCCCCATGGGTGACACTCT桃 RAAGTTCCTTGACGCGTTTCG 69 bp Internal Transcribed Specer(ITS)geneP FAM-CCGGTCAAACAACGAACCCCGG-BHQI
5.2三氧甲烷（氯仿）.5.3异丙醇.5.4CTAB 提取缓液：20g/L CTAB，1.4 mol/L NaC1，0.1mol/1Tris-HCI 0.02mol/LNEDTA 5.5CTAB沉淀液：5g/L CTAB，40mmol/L NaCl. pH 8.0.5.670%乙醇（体积分数）.5.7蛋白酶K（20mg/mL）.5.8实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U~2U（Unit，酶学单位）的Taq酶、1×PCR buffer、2.5 mmol/L~4.0 mmol/L 的 Mg²0.2U~1 U的UNG 酵、0.2mmol/L 的 d（A C G)
TPs、0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料.
5.910×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4).200mmol/LKCI 15mmol/LMgCl
6仪器设备
6.1实时荧光PCR仪.6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计. 6.3恒温水浴锅.6.4离心机：最大离心力不小于12000g.6.5微量移液器：0.5μL~10μL，10μL~100μL，20μL~200μL 200pL~1000pL.6.6粉碎装置，6.8pH计. 6.7涡旋震荡器.6.9量筒：容量50ml.6.10烘箱.
7检测步骤
7.1样品前处理
鲜果、冷冻果样品直接粉碎，6000r/min离心，取沉淀物部分.果干、果酱、蜜饿类样品先用蒸馏水清洗3次，再粉碎.
果汁样品取适量15000r/min离心30min，取沉淀部分.
7.2DNA提取
取粉碎后的样品50mg~200mg，加人1mL裂解液，同时加人0.01倍体积的20mg/ml蛋白酶K.65C温育1h~2h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加人适量CTAB提取缓冲液；取出后12000r/min离心10min，转移上清至2mL离心管中，加人0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震茜混匀.12000r/min转速下离心10min：转移上清至另一灭菌的离心管中，再加人0.7倍体 积的三氧甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12000r/min离心10min；转移上清至干净离心管中，加人等体积的CTAB沉淀液混匀，室温沉淀1h；弃上清，加人350pL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀；加人0.8倍体积的异丙醇或2倍体积一20C冰箱中预冷的无水乙醇混匀，一20C放置30min.12000r/min4C离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干.加人5pL~100μL双蒸水，室温10min，混匀，一20C保存.
上述模板DNA均可用等效DNA提取试剂盒提取.
7.3DNA浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A和A，DNA的浓度按照式（1）计算：
式中：
（-DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）；
A-260nm处的吸光值；
N--核酸稀释倍数.
