中国实验动物学会团体标准 T/CALAS22-2017
实验动物 小鼠诺如病毒检测方法
Laboratory animal - Methods for murine norovirus
中国实验动物学会发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则编写.本标准附录为资料性附录.本标准由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查. 本标准由中国实验动物学会归口.本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草.本标准起草单位：中国食品药品检定研究院、广东省实验动物监测所.本标准主要起草人：李晓波、付瑞、袁文、岳秉飞、黄韧、王吉、张钰、王淑菁.
实验动物小鼠诺如病毒检测方法
1范围
本标准规定了小鼠诺如病毒（MNV）的检测方法、试剂等.本标准适用于小鼠诺如病毒的检测.
2规范性引用文件
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用面构成为本标准的条文.本标准出版时，所示版本均为有效.标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用系列标准最薪版本的可能性.
GB/T14926.50-2001《实验动物酶联免疫吸附试验》GB/T14926.52--2001《实验动物免疫荧光试验》GB19489《实验室生物安全通用要求》
3病毒的分离与鉴定
3.1基本原理
样本经过处理，样本中的病毒粒子释放，将处理后的样本接种到病毒的易感细胞，在合适的条件下，病毒粒子在易感细胞中增殖，并产生典型的细胞病变，可通过显微镜进行观察判断.
3.2主要试剂与器材
208第正霜买验动物检测方法系列标准
人-70℃冰箱保存.
3.3.2样品的处理
取上清，上清用0.22um微孔滤膜进行过滤，进行后续试验. 约100mg粪便样品加人900uL无菌PBS，涡旋震荡混匀，12000r/min离心10min，
3.3.3接种
将过滤液接种至已长成单层的RAW264.7细胞，接种量为培养液量的10%，在含5%CO的37℃培养箱中吸附1h，倒弃，加人含10%新生牛血清的DMEM培养基继续培养.
3.4结果判定
3.4.1观察
接种后36~72h，显微镜观察细胞是否出现细胞病变效应（CPE），如未出现CPE，将细胞冻融3次，盲传3代，如仍无CPE，判为小鼠诺如病毒阴性；如出现CPE，需进行下一步鉴定.
3.4.2鉴定
出现CPE的细胞培养物，进行免疫荧光法或分子生物学方法（如普通PCR或荧光PCR）进行鉴定确认.
4免疫荧光试验
4.1基本原理
含有病毒抗原的细胞（组织培养细胞或动物组织细胞）固定于玻片上，遇相应抗体形成抗原抗体复合物.此抗原抗体复合物仍保持其抗原活性，可与相应的第二抗体荧光素结合物结合.荧光素在紫外光或蓝紫光的照射下，可激发出可见的荧光.因此，在荧光显微镜下以荧光的有无和强弱判定结果.
4.2主要试剂与器材
4.2.1试剂 4.2.1.1RAW264.7细胞.4.2.1.2DMEM高糖培养基.4.2.1.3新生牛血清.4.2.1.4无菌PBS.4.2.1.6伊文思蓝. 4.2.1.5荧光素标记的小鼠二抗.4.2.1.7小鼠诺如病毒毒种（分离或购买均可）.4.2.1.8标准MNV抗体阳性和阴性小鼠血清.4.2.1.9胰酶.4.2.1.1050%甘油. 4.2.2器材4.2.2.1荧光显镜.4.2.2.2二氧化碳培养箱.
4.2.2.3生物安全柜.
4.2.2.4细胞培养瓶、移液管、载玻片、盖玻片、湿盒等.
4.3操作步骤
4.3.1抗原片的制备
此步骤在生物安全柜操作，将MNV病毒接种至RAW264.7细胞，待出现病变后用胰酶消化下细胞，PBS洗三次，用适量PBS悬浮细胞，将细胞悬液滴于玻片孔中.同时消化未感染病毒的同批细胞，滴加同一玻片另一孔内，作为正常细胞对照.孔内滴加的细胞以细胞铺开、不重叠为宜.室温干燥后，冷丙酮（4℃C）固定10min.PBS漂洗后充分干燥，置于-20℃备用.
4.3.2加样
取出抗原片，室温干燥后，将用PBS1：40稀释的待检血清和标准血清滴于抗原片上，每份血清加两个病毒抗原孔和一个正常对照孔，置湿盒内，37℃解育30min.
4.3.3洗涤
将抗原片取出，用PBS振荡洗涤三次，每次5min，室温干燥.
4.3.4加二抗
用0.01%的伊文思蓝将荧光标记的二抗1：200稀释，滴加与抗原片上，置湿盒内，37℃孵育30min.
4.3.5洗涤：PBS洗三次，每次5min.
4.3.6结果观察
50%甘油封片，荧光显薇镜下观察.
4.4结果判定
在阴性、阳性对照成立的的条件下，及阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均无荧光；阳性血清与正常细胞反应无荧光，与病毒感染细胞反应有荧光，即可判定结果.4.4.1待检血清与正常和病毒感染细胞均无荧光反应，判为阴性.
4.4.2待检血清与正常细胞反应无荧光，与感染细胞有荧光反应，判为阳性.
5酶联免疫吸附试验（ELISA）
5.1基本原理
包被于固相载体表面的已知抗原与待检血清中的特异性抗体结合形成免疫复合物.此抗原抗体复合物仍保持其抗原活性，可与相应的第二抗体酶结合物结合.在酶的催化作用 下底物发生反应，产生有色物质.颤色反应的深浅与待检血清中所含有的特异性抗体的量成正比.
5.2主要试剂与器材
5.2.1试剂5.2.1.1抗原：人工表达的MNV重组抗原或经高速离心纯化的病毒抗原. 5.2.1.2酶结合物：辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体.5.2.1.3对照血清5.2.1.3.1阳性血清：MNV抗原免疫小鼠获得的抗血清.
