ICS 11.220
B
中华人民共和国国家标准
GB/T 35908-2018
蜜蜂白垩病诊断技术
Diagnostic techniques for chalkbrood of honey bees
2018-02-06发布
2018-09-01实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
发布
中国国家标准化管理委员会
GB/T 35908-2018
目
次
前言...
1 范围.....
2
规范性引用文件
3 缩略语
4 试剂和材料
4.1 水.....
4.2固定液、染色液和培养基
4.3 PCR检测方法试剂
4.4 引物序列及对照样品
5
仪器设备
6 临床诊断
6.1流行病学
6.2箱外观察
6.3 开箱检查
6.4结果判定
7实验室诊断
7.1
采样
7.2 镜检法
7.3
分离培养
7.4PCR检测
8 综合判定
附录A(规范性附录)固定液、染色液和培养基配方
附录B(规范性附录)
PCR检测方法试剂的配方
附录C(资料性附录)
蜜蜂白垩病发病蜂群的巢门前死虫和病虫症状
附录D(资料性附录)
蜜蜂白垩病发病蜂群的病脾状态
附录E(资料性附录)
蜂球囊菌的光镜下显微图像
附录F(资料性附录)
蜂球囊菌PCR产物电泳图
附录G(资料性附录)蜂球囊菌PCR产物参考序列
GB/T 35908-2018
前
言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准由中华人民共和国农业部提出，
本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口
本标准起草单位:中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫
局、福建农林大学、福建赛福食品检测研究限公司
本标准主要起草人:郑腾、张体银、宋战昀、黄少康、李宋钰、张志灯、陈日春、王武军、白泉阳
林素洁.
GB/T 35908-2018
蜜蜂白垩病诊断技术
1范围
本标准规定了蜜蜂白垩病的诊断技术
本标准适用于蜜蜂白垩病诊断和病原检测.
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括的修改单)适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB19489 实验室 生物安全通用要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件，
EB:溴化乙锭(Ethidiumbromide)
PCR:聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)
SDS:十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate)
4试剂和材料
4.1水
本标准所用水应符合GB/T 6682中一级水的规格要求.
4.2 固定液、染色液和培养基
乳酸苯酚固定液(配方见附录A中的A.1)、乳酸棉蓝染色液(配方见A.2)、病原菌分离培养基(配
方见A.3).
4.3 PCR检测方法试剂
亚精胺-SDS缓冲液(配方见附录B中的B.1)、饱和酚、氯仿、3mol/L的酷酸钠(pH5.5)(配方见B.2)、
TE缓冲液(配方见B.3)、0.5xTBE缓冲液(配方见B.4)、上样缓冲液(配方见B.5)、1.5%琼脂糖凝胶
(配方见B.6)、TaqDNA聚合酶(5U/μL)、10xPCR缓冲液、dNTPMix(10mmol/L).
4.4 引物序列及对照样品
上游引物(F):5'-TGT CTG TGC GGC TAG GTG-3';
下游引物(R):5'-GAW CAC GACGCC GTC ACT-3':扩增产物为442bp.
蜜蜂蜂球囊菌阳性对照，由指定单位提供或合成含有阳性片段的质粒.
蜜蜂蜂球囊菌阴性对照，可以选用健康且无白垩病临床症状的幼虫作为阴性对照.
GB/T 35908-2018
5 仪器设备
5.1 光学显微镜.
5.2 恒温培养箱(35℃±1℃)，
5.3 A2型二级生物安全柜.
冰箱(2℃~8℃和-20℃).
5.4
5.5
PCR仪.
5.6
电泳仪.
5.7
冷冻离心机.
5.8 凝胶成像系统.
6 临床诊断
6.1流行病学
西方蜜蜂的幼虫易患蜜蜂白垩病，病虫和病菌污染的饲料、蜂具是主要的传染源，菌丝和孢子均具
有侵染性，它们可由成年蜂或蜂螨体表携带并在蜂群内或蜂群间传播.白垩病主要引起老熟幼虫和封
盖幼虫死亡 3日龄~4日龄雄蜂幼虫和4日龄~5日龄工蜂幼虫最易感染白垩病，蜂场内蜂群的发病
率可达10%~50% 幼虫感染率为5%~40% 成年蜂虽不易感染，但是病原的携带者和传播者，白垩
病的发生有明显的季节性，多发生在春夏的6月~8月高温、高湿季节，凡是日照长、地势高燥的地方，
白垩病发病率低 一般为3%~5% 或根本不发病;而气温高、湿度大、光照不足的地方 白垩病危害
严重，
6.2 箱外观察
患病蜂群的巢门口可见被工蜂拖出的幼虫干尸 质硬，有的干尸呈苍白色 似葵花仁状，表面有一层
绒毛膜，掰开幼虫干尸可见内心为浅棕色;有的干尸为部分或全部黑色，似西瓜子状，表面有一层黑色颗
粒状物质.(参见附录C)
6.3开箱检查
从患病蜂群中提出封盖子脾，在已封盖的部分有呈星点式分布被工蜂咬开的巢房，可见内有向一侧
贴壁的幼虫干尸，形态完整，质地柔韧，无光泽，无臭味，用镊子取出后，可见有的为白色，有的为部分或
全部黑色，健康的蜜蜂幼虫是呈有光泽、珍珠样外观.(参见附录D)
6.4结果判定
结合该病的流行特点，若蜂群出现6.1和6.2的典型症状，即可判定为临床诊断阳性.
7实验室诊断
7.1采样
根据临床诊断结果 选择疑似感染的蜂群采集蜜蜂幼虫样品.采样时，应尽量无菌采集变色或死亡
幼虫 样品保存于2℃~8℃的条件下 24h内送实验室检测.
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