T/GDMDMA 0052-2025
目次
前言 1范围 2规范性引用文件 3术语和定义 4试验原理 5设备、耗材与试剂 6供试液和对照组样品的制备 7试验用细胞 8试验步骤 9结果判定 10试验报告 附录A（规范性）试验用细胞准备
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前言
起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。
本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由广州创尔生物技术股份有限公司提出。
本文件起草单位：广州创尔生物技术股份有限公司、瑞珠生物医学（深圳）有限公司、深圳市迈捷生命 科学有限公司、广州德施普新材料科技有限公司、广东医科大学、广东药科大学、广州中医药大学、华南农 业大学生物质工程研究院、新型生物材料与高端医疗器械广东研究院、广东省医疗器械质量监督检验所、 广州检验检测认证集团有限公司、广东赤萌医疗科技有限公司。
本文件主要起草人：罗思施、孟媛、达琦、张建光、张万龙、彭新生、时军、王利胜、毕桂灿、林晓娟、李婷、 南方、徐瑶、王梦杰、杨兆滢、刘泽邦、张正尧、王银港、黄立静。
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组织提取胶原蛋白细胞划痕试验 操作规程
1范围 本文件规定了动物组织提取胶原蛋白细胞划痕试验的试验原理、试验试剂、耗材与设备、供试液和对 照组样品的制备、细胞制备、试验步骤、结果判定与试验报告等内容。
本文件适用于评估可溶或者部分可溶的组织提取胶原蛋白促进细胞迁移的能力。
2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件。
仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件。
YY/T1955-2025组织工程医疗器械胶原蛋白术语 3术语和定义
YY/T1955一2025界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3. 1 组织提取胶原蛋白tissue-derivedcollagen
经特定处理后，得到的具有三螺旋结构的大分子蛋白质。
[来源：GB/T45992-2025,3.1.有修改] 3. 2 细胞划痕试验cell scratch assay 一种在体外评估细胞迁移能力的试验方法。
注：又称伤口愈合试貌（wound healing assay）。
4试验原理
在体外培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其他硬物在细胞生长汇合的区域进行划线操作，人为 制造一个无细胞的空白区域，称为“划痕”。
划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕“愈合。
通过测 量细胞在一定时间内（如24h、48h）从划痕边缘向划痕中心迁移的面积，与初始划痕面积进行比较，以此 计算细胞迁移的程度。
试验通常应设定对照组和供试组，对照组包括阳性对照组和空白对照组，通过对 比不同组之间细胞迁移的程度，以此评价受试物促进细胞迁移的能力。
5设备、耗材与试剂
5.1设备 二氧化碳培养箱、移液器、生物安全柜或超净工作台、倒置显微镜、恒温水浴锅、离心机、冷冻离心机、
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5.2耗材 细胞培养瓶、24孔细胞培养板（贴壁型）移液器枪头、冻存管、离心管、试剂瓶、0.22μm无菌滤膜、精 密pH试纸。
5.3试剂 冰醋酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）胎牛血清、纯化水、DMEM培养基（无谷氨酰胺、无钙离子、葡 萄糖含量4.5g/L.）胰蛋白酶-EDTA（0.25%）、磷酸盐缓冲液（PBS）、1-谷氨酰胺溶液（200mmol/L. 100×）重组人表皮生长因子（animal-free rebinant human epidlermal growth factor,EGF）、钙离子吸附 树脂Chelex 100 Resin0.1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA，细胞培养用）青霉素-链霉素混 合溶液（100×）。
5.4试剂配制 5.4.10.1mol/1.的醋酸溶液：准确量取5.72mL冰醋酸.用纯化水定容至1000mL。
5.4.24mol/1的氢氧化钠溶液：称取4.00g氢氧化钠，加入纯化水溶解并定容至25mL。
用0.22pm 滤膜过滤，制备成4mol/L.氢氧化钠溶液储备液.室温保存。
5.4.3去钙离子血清：称取1.50g钙离子吸附树脂Chelex100Resin至50mL离心管，加人30mL胎牛 血清，在2℃～8℃条件下温和且充分混合2h.离心或者静置去除树脂，取上清液于无菌环境下用0.22um 滤膜过滤，即得到去钙离子血清。
可将离心管水平固定于翘板摇床或采用其他替代方式，确保钙离子吸附树脂Chelex100Resin始终 均匀分散于胎牛血清中，无局部沉淀或分层。
混合过程中避免剧烈搅拌或高速振荡，防止胎牛血清中活 性成分破坏。
5.4.4基础培养基：按照99：1的体积比将DMEM培养基（无谷氨酰胺、无钙离子、葡萄糖含量4.5g/L） 与L-谷氨酰胺溶液（200mmol/L.100×）混合。
5.4.5完全培养基：按照9：1的体积比将基础培养基与去钙离子血清混合。
5. 4.6EGF母液（0.1 mg/mL):开瓶前4°℃,4 000r/min离心5min.加人适量恢复至常温的0.1%BSA （细胞培养用）溶液，使终质量浓度为0.1mg/mL。
轻轻混匀溶解EGF粉末。
待EGF粉末充分溶解后短 暂离心分装并于超低温冰箱保存。
5.4.7EGF储存液（10μg/mL）:将EGF母液（0.1mg/mL)用0.1%BSA（细胞培养用）溶液进行10倍 稀释，轻轻吹打混匀.分装并放置于一80℃超低温冰箱中保存。
6供试液和对照组样品的制备
6.1通用要求 供试液制备过程中应避免加热（样品温度不应超过其热变性温度）或冷冻，同时应避免激烈的振荡、 搅拌或超声处理，因为加热或剪切力等因素会导致供试液中的胶原蛋白变性，从面影响测试结果的准 确性。
供试液一般宜在测试的当天配制，必要时可提前1d配制并在2℃~8℃冰箱储存。
供试液配制过程保持无菌操作。
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6.2供试液的制备 6.2.1受试物溶解 受试物为可溶性的组织提取胶原蛋白固体时.称取适量受试物，加人0.1mol/1的醋酸溶液，使受试 物充分溶解，溶解后的终质量浓度为1mg/mL~5mg/mL。
受试物为组织提取胶原蛋白凝胶或溶液时，参照上述方法进行稀释，使终质量浓度为1mg/mL～ 5 mg/mL。
若受试物为部分可溶性的胶原蛋白样品，如受试物为经过交联或自组装等方式处理的组织提取胶原 蛋白时，应在充分溶解，并经离心或过滤去除不溶解部分后，采用经验证的方法检测受试物溶液中胶原蛋 白的浓度。
若受试物为质量浓度较低的组织提取胶原蛋白溶液时，可直接用于供试液制备。
6.2.2供试液制备 将上述溶解后的受试物，用基础培养基稀释10倍作为供试液。
根据测试需要，可用基础培养基继续 稀释，制备不同质量浓度的供试液。
在配制过程中，应充分混匀，避免产生气泡，确保样本均一性。
当采用含酚红的基础培养基时.若供试液颜色变黄.使用4mol/L或稀释后的氢氧化钠溶液调节pH 至7.0±0.2。
当采用不含酚红的基础培养基时，应使用精密pH试纸检测供试液的pH.并使用4mol/L或稀释后 的氢氧化钠溶液调节pH至7.0±0.2。
在调节pH过程中应记录氢氧化钠溶液的添加量，以计算供试液中胶原蛋白的最终质量浓度。
在供试液中宜添加浓度为1%的青霉素-链霉素混合溶液。
6.3阳性对照 阳性对照宜使用重组人表皮生长因子（animal-free rebinant human epidermal growth [actor. EGF）.其他经证明能稳定促进细胞迁移的物质也可作为阳性对照使用。
从-18℃或以下温度的冰箱中取出一管经分装的EGF储存液（10μg/mL）.于2℃～8C冰箱放置 10min使其彻底溶解，轻轻吹打混匀.使用基础培养基稀释至5ng/ml~10ng/ml。
阳性对照应储存于 2℃~8℃冰箱，一个月内有效。
6.4空白对照 以基础培养基作为空白对照。
7试验用细胞
7.1细胞种类选择 人表皮角质形成细胞是构成皮肤的一种主要细胞。
人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）适用于评 价终产品使用部位为皮肤表面的组织提取胶原蛋白的细胞迁移能力。
此外，宜根据终产品的预期使用部位，选择适合的细胞种类，参考本法或其他经验证的方法进行试验。
7.2细胞来源 采用人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞），编号：KCB200442YJ.购自中国科学院昆明细胞库。
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