中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 1199-2003
Protocol of the polymerase chain reaction for detecting genetically modified ponents in cotton
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本称准的附录人为资料性附录.本标准由国家认证认可流督管理委员会提出并日口. 本标准起车单位：中毕人民共和国天律出人碳检验检疫局.本标准主要起草人，部文类、期府、唐行寿、杨蹈勇、何靠， 本标准系首改发布的检验检疫行业标准，
棉花中转基因成分定性PCR 检测方法
本标准配定了抗膜组目民典编花转基四成分的定性PCR独到方造.
本标准适用于抗鳞组目昆或据花SGK321 SGK9708 GK1.GK2、GK3 GK5 GK12 GK19 GK22、GK95-1（晋桃26号）、Bolgsrd（保特棉）中转基因成分的定性PCR检测.
2规施他引用文件
的修改单（不包猫款误的内容）或够订新均不适用于本标准，然面，脱助根整本标车达成持议的备方蛋究 下列文件中的条款通过本样准的引用到成为本标准的条款，凡往明日期的积用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本，凡是不性日期的引用文件，其最新斯本适用于本标准，
G8/T6582分析实验室用水规椎板实验万然SN/T113基四分折检测实验室技术要求 SN/T11H推物及其产品转基四武分检测换科和制样方编SN/T1204植物及其加工产品中转基因底分实时费光PCR定性验验方位
3本、定文和细略语
下列水语，定文和增略添通河于本标准，
3. 1
荟因tmg
行表达，以便证物种获得新的品种特征. 将物种本身不具有的、来据于其他物种的验据DNA序列，通过各种导人手级，使其在谈物种中进
3. 2
联合路组式反应polymurse chais reactlo (PCR)
计的用条引物分别与模反DNA两条证上相应的一段互补序列发生退火面相互继合，授看在DNA重合 核板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA账合障作用和活宜的反应条件下：板据板序列设的作用下以四种脱氧核糖核（NTP）为底物笑引物得以能件，些后不新宣置变性、通火和延神达一提琴，使款扩理的基国片积以儿何价数矿增，
3.3路备
3.3.1PCR.polymerase chin reactio.R合国链式反度，院称PCR 3.3.2DNA，deoxymbenucleic acid.脱氧技糖披酸.3.3.3dNTP，deoxyrionutleoide trighospha，氧俄苷三确貌 3. 3. 4dATP;deoxyedenoaine triphospbate B氧腺管三确能 3.3.5dCTPdeoxyeytidine triphosphate.鼠氧脂节三确酸. 3.3.6dGTPdeoxyguaosine triphosphate-服氧乌甘三调股.3.3. 7dTTP deoxythymidine triphorphate.服氧胸甘三确股.
SN/T
3. 3. 15NPT1l neomgcin3-phosphotrsssferese gene-新部案-3'-确能转移期基器
3.3.16NOS.terminanor of nogiine symthast gene，原孩合成签因路止子.
3. 3. 17 CrylA(b)-Cry IA (c) e synthetic gene encodes 608 ansino acida inaectisidal-artivu trunated produet identical to thet of crylA(b) gete and eryIA(c?) gene ef Becifles dkaringiexrir ss/ap.Rarnta*stnHD-1aodHD-13苏云金芽的杆菌杀盘毒强白oryfA（a）和cryA（r）的合成基图.
3. 3. 18 CrylA(c? e synthetic gene encodes insectieidalb-ative truncated product idantical to that ofcryIAGc)gene of Bocius thuringieni subsg-Krmai steain HD-7a 苏装金茅拍杆图条点事驱自crylA(e）的合成基因.
3.3.19GUS.beta-gocuronidase gent3-能期甘R国基因.
3.3.2918S rDNA 18S rihosomal DNA gene.18S 核糖体 DNA 基因
4防污染措施
推测过程中防止交叉行染的施检黑SN/T1193中的规定执行.
5抽祥和制标
5.1取样
拨照SN/T1194中规宠的方法执行.
5.2样
取约19g棉花群品，在经121℃.30min高医价事处理过的研体中加人板氮快速研需至特品析末联教约0.5mm大小，快遇人1.5nL的高心管中，于一2保存.
6测定方法
6.1慕堰
特异性扩添外原差因的DNA元斯，服福PCR扩增结果，判新波祥品中是否含有转基因成分.
6.2试到和料
6.2.1引物根表1的序列迷行引物合成.加水配制成100μ=oi/L.储存，直垫用于PCR到试的引物 除分有能定外，其他试前为分析纯或生化试所，水为股照GB/丁4682规定的一级水.堆度为5pml/L..其中外国属因的有关偏息参见附录A，
表1检测转基因精花内、外源基因的引物序列
5'-ttgr-trorwt-irphggr? 引物序月185 eDNA 内 5'rtgcgprgeerroet? 5'-gcet-aatgosic}' 137 54CaV 368 外源 5'-prgtstratrgy-tper-? 195 54
1(值)
被验测著 5'gerter-sggrrgr-urg- 引物列 扩理片股长展/bp 通火度/NOS 外源 5'rtcr-tagmgrgpt-} 5'-rrgrgre 180 54GUS 5'-mrag-oggtsorr3’ 210 04IIL4N 外 5'-wgugat-anmrnggrgargr? 1$$ 4CrylA(b)- CyfA(e) 5'p-peoear-goger! 216 54CrylA(e) 外 5°-g-(ea-g--g--tc0- 5'-00-(--1-(1-0-0 119 6)
6.2.21mol/LTris-HC1级冲液（pHs.0)，称取121.1g三起甲基氨基甲烧（Tris)，治于800mL水 中，提件.加人维酸4Zm1.冷句至室，用特盐酸准确调节pH至6.0.加水定容至1L.分装后高压灭图备用，
6.2.30.5mo/LEDTA（pH8.0）.在800ml.水中加人186.1g二水乙二股四乙酸二纳（Na-EDTA2HO).用磁力提拌基新烈现拌-用机化销调节液pH值至8.0（约需20g氢化钠 腔）.后加水定容至1L，分装后高压灭菌备用，
6.2.4DNA抽提级冲液，量数100mL 1 mol/LTris-盐股.50mL0.5mol/LEDTA.称章20.0十六 烧基三甲基膜化胶（CTAB） 81.816g氢化钠.20g聚乙姆略烧酮-40（PVP-40）.加水解至1L，分装后高压灭菌备用，
6.2.5CTAB现院威：称取5.0gCTAB.2.3376g黑化销.加水指解定容至1L.分装后商压灭菌 备用.
6.2.61.2mcl/1.氢化纳落痕：格取70.128g化.加水解定物至1L.分服后商压天菌备用
6.2.7Tr和册.
6.2.8三甲统，
6.2.9被氮.
6.2.10外丙，
6.2.1170%乙B.
6. 2. 12 TE 冲 鹿(pH8.0) 量取 30 mL 1 mol/L Triv-HCI(pH8.0)和 2 mL 0. 5 mol/L EDTA （pH8.0），加水定容至1L，分联后高压买离备用.
既化键（MgC) 0.1%明胶.
6.2.1410×氧化锁:25 mmol/L
6. 2. 1510XdNTPs 含 4ATP.d4TTP dCTP eGTP 各 2. 5 mmol/L
6. 2. 16 7ey B 5 U/pl
6. 2. 17 RNaseA 10 =g/mL
6.2. 18模化乙键 10 mg/mL
6.2.19DNA分子量排记物50 bp~800bp.
6.2.20琼，
6.2.2150×TAE级冲浆B取48Mg Tris.量取114.2 mL冰乙M.200mL0.5mol/LEDTA （pHL0），于水中，北容至2L、分款后高压灭备用.
