Technical specification for PCR-based identification and genotyping ofEchinococcusgranulosus
中国兽医协会 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由中国兽医协会提出并归口.
本文件起草单位：新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）、新疆医科大学第一附属医院、吉林大学动物医学学院、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站、新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所、新疆农业大学、中农华威制药股份有限公司.
本文件主要起草人：潘星羽、吾力江卡马力、张壮志、赵莉、张文宝、刘明远、刘晓雷、班万里、刘帅、李军、丁静、张旭、周婷婷、齐文静、颜明智、吴小霞、王冰洁、游锡火、喀迪尔丁艾尔肯、王延、柳梦婕、王丽君.
引言
细粒棘球绦虫（Echinococcus gramelosus sensu lato）是一个由多个物种和基因型组成的寄生虫复合体，可引发严重的人畜共患病一囊型包虫病.包虫病呈全球性分布，几乎在的大洲都有病例报道.我国是包虫病最严重的国家之一，多呈地方性流行，主要分布在9个省（自治区），包括新疆、四川、青海、甘肃、宁夏、西藏、内蒙古、陕西、云南和新疆生产建设兵团等地区，涉及我国北部、西北和西南部农牧区368个县，分布在牧区和半牧区的区域：其中青海、西藏和新疆地区的感染率最高，提示包虫病在高海拔、寒冷、潮湿、高降雨地区棘球感染率高.
犬科动物（如家犬）细粒棘球绦虫作为终末宿主，成虫寄生于其小肠：家畜（如羊、牛）或野生动物作为中间宿主，幼虫在其内脏（如肝、肺）中发育为棘球囊肿.人类是偶然中间宿主，通常因误食被犬科动物粪便中虫卵污染的水源或食物而感染.本标准涉及四个主要物种：狭义型细粒棘球绦虫（G1/G3）、马棘球绦虫（G4）、奥氏棘球绦虫（G5）、加拿大棘球缘虫（G6/G7、G8/G10）等.不同基因型在宿主适应性、致病性和地理分布上具有明显差异，如G1/G3型常见于人类及绵羊等家畜，G4型主要感染马，G5型多见于牛，G6型与骆驼和山羊相关，G7型常见于猪，而G8和G10型则主要在鹿科动物中循环.
本规范的制定参考了国际标准及国内相关技术规范，结合实验室实践经验，旨在为科研机构、疾病防控部门及兽医诊断实验室提供标准化的技术指导，推动囊型包虫病的精准诊断与科学防控.
细粒棘球绦虫物种及基因型PCR鉴定技术规范
1范围
本文件规定了运用限制性片段长度多态性-聚合酶链式反应（RFLP-PCR）和多重聚合酶链式反应（MultiplexPCR）技术鉴定细粒棘球绦虫物种及基因型的技术要求.
本文件适用于细粒棘球缘虫基因型的实验室检测、流行病学调查以及检验检疫.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.
Cal:钙网蛋白（Calreticuline）COXl：细胞色素c氧化酶亚基I（Cytochrome coxidase subunit I） COX2：细胞色素c氧化醇亚基II（Cytochrome c oxidase subunit II）Elp：埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白样蛋白（Ezrin-radixin-moesin-likeprotein）G1/G3：狭义细粒棘球绦虫，细粒棘球缘虫G1基因型/G3基因型（Echinococcus gramulosus sensuG4：细粒棘球缘虫 G4基因型（Echinococcus granulosus G4）G5：细粒棘球缘虫G5基因型（Echinococcus granulosus G5）G6/G7：细粒韩球绦虫G6/G7基因型（Echinococcus gramalosusG6/G7）G8/G10：细粒棘球缘虫G8/G10基因型（Echinococcus gramulosus G8/G10）ND1:NADH 脱氢酶亚基 1 (NADH dehydrogenase subunit I) MultiplexPCR：多重聚合酶链式反应PCR：聚合酵链式反应（polymerase chain reaction）RFLP：限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism）
T/CVMA 338-2026
5样本采集与形态学鉴定
5.1总则
样品的采集、保存与运输按照NY/T541执行.生物安全要求按照GB19489的规定.
5.2样本收集成虫、虫卵、原头和囊壁样本的采集见附录A.
5.3样本形态学鉴定成虫、虫卵、原头和囊壁样本形态学鉴定见附录B.
6RFLP-PCR检测方法
6.1主要试剂
6.1.1除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，所用水应符合GB/T6682中二级水的要求，试剂均用无RNA酶的容器分装.6.1.2组织基因组DNA提取试剂盒（商品化试剂）.6.1.32×TaqPCRMix（商品化试剂）.6.1.4限制性内切酶AluI（商品化试剂）.6.1.5DL2000 Marker（商品化试剂）.6.1.6DNA上样缓冲液（商品化试剂）.6.1.750×TAE缓冲液（商品化试剂）.6.1.8保存液，配制方法见C.1.6.1.91×TAE缓冲液，配制方法见C.2.6.1.101.0%琼脂糖，配制方法见C.3.6.1.11阳性对照：重组质粒，制备过程见附录D.6.1.12阴性对照（空白）：无核酸酶水（商品化试剂）.
6.2主要仪器设备及耗材
6.2.1超净工作台.6.2.2离心机.6.2.3恒温水浴锅.6.2.4分析天平.6.2.5PCR扩增仪.
