GB/T 14926.46-2008
前言
GB/T14926《实验动物》共54个部分，为不同微生物和病毒检测技术方法。
本部分自实施之日起代替GB/T14926.46-2001《实验动物钩端螺旋体检测方法》。
本部分与GB/T14926.46-2001相比主要技术差异如下： a）原理部分增加显微镜凝集试验原理： b）原标准中"6.1试管凝集实验”修改为“显微镜凝集实验”："6.1.2.2表1钩端螺旋体定量 显凝试验操作方法”更改为”钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法”； c）修改原标准中关于酶联免疫吸附试验的内容： d）在原标准中增加了"7结果判定”。
本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草。
本部分主要起草人：范薇、田克恭、贺争鸣。
本部分所代替标准历次版本发布情况为： GB/T 14926. 46-2001。
GB/T 14926.46-2008
实验动物钩端螺旋体检测方法
1范围 GB/T14926的本部分规定了实验动物钩编螺旋体的检测方法。
本部分适用于犬钩端螺旋体的检测。
2规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T14926的本部分的引用而成为本部分的条款。
凡是注日期的引用文 件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。
GB/T14926.42实验动物细菌学检测标本采集
GB/T14926.50实验动物酵联免疫吸附试验 3原理 钩端螺旋体抗原与相应特异性抗体相遇，在适宜的电解质存在下发生凝集现象，此种凝集一般须用 暗视野显微镜检查。
钩端螺旋体抗原与待检血清中的特异性抗体结合，形成抗原抗体复合物，此抗原抗体复合物仍保 持其抗原活性，可与相应的第二抗体酶结合物结合。
在酶的催化作用下底物发生反应，产生有色物质。
额色反应的深浅与待检血清中所含有的特异性抗体的量成正比。
4主要设备和材料 4.1普通恒温培养箱。
4.2实体显微镜。
4.3恒温水浴箱。
4.4高速离心机。
4.5超声波细胞粉碎器。
4.6酵标仪。
4.7微量加样器，容量5pl~50pL和50yL~200μL。
5培养基及试剂 5.1大型钩端螺旋体标准抗原。
5.2标准阳性血清。
5.3标准阴性血清。
5.4生理盐水， 5.5显微镜凝集抗原：各群钩端螺旋体标准株接种Korthof培养基，28C培养5d~7d.取样作暗视 野显微镜检查，每400倍视野不少于50条，运动活泼并无自凝现象者，可作为抗原。
5.6ELISA抗原 5.6.1钩端螺旋体培养：各群钩端螺旋体标准株接种Korthof培养基，28C培养5d~7d
GB/T 14926.46-2008 5.6.2生长良好的培养物用10000r/min离心30min.沉淀用PBS在相同条件下洗2次。
5.6.3上述沉淀用PBS悬浮，超声波打碎后，1000r/min离心20min，上清即为ELISA抗原。
5.7酵结合物：辣根过氧化物酶标记羊或免抗犬IgG抗体，辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A（SPA）。
5.8阳性血清：钩端螺旋体免疫SPF犬所获得的血清，或自然感染犬后所获得的血清。
5.9阴性血清：无钩端螺旋体感染犬血清。
6检测方法 6.1显微镜凝集实验 6.1.1检测程序 检测程序见图1。
倍比稀释 加入标库抗原37温箱2 给果列定
凝集不凝复
价大于等于1:20阳性
给果报告 图1检测程序 6.1.2操作步骤 6.1.2.1采样 采血、分离血清，采样方法参照GB/T14926.42执行。
6.1.2.2血清稀释 参照表1进行。
表1钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法 凹孔板编号123456789101112 生理垫水/mL0,160.10. 10,10,10.10, 10.10, 10.1 待检血请/mL0. 04 0.1 0.10.1 0.1 0.1→0.1 →0.10.1 弃去0.1 阴性血清/mL0.1 性血清/mL0,1 标准抗原/mL0.10.10,10.10.10. 10, 10, 10,10, 10.10,1 血清最终稀释度1/101/201/401/801/1601/3201/6401/1 2801/2 560 2
GB/T 14926.46-2008 6.1.2.2.1待检血清灭活：将待检血清以56C水浴灭活30min后备用。
6.1.2.2.2取96孔板，第1孔加人生理盐水0.16mL，以后每孔加人生理盐水0.1mL，一直加到 第9孔。
6.1.2.2.3在第1孔中加人血清0.O4mL.混勾后，吸取0.1mL到第2孔，如此类推，直到第9孔，弃 去 0. 1 mL- 6.1.2.3对照 另标明10、11、12孔第10孔加人阴性血清0.1mL，第11孔加入阳性血清0.1mL第12孔加人 生理盐水0.1mL. 6.1.2.4加入抗原
11320，11640，1：1280.1：2560.具体操作见表1.置37C温箱2h，取出后摇匀，用接种环挑取 各孔中的反应物置于载玻片上，在暗视野下观察结果。
6.1.2.5结果判定 结果判定如下： a）十十十十：几乎全部钩编螺旋体呈蝌蚪状或折光率高的团块，或有大小不等的点状或块状残 片，仅有少数游离的钩编螺旋体； b）十十十：75%的钩编螺旋体被凝集，大部分呈块状或蜘蛛状，尚有25%菌体游离； c）++：50%左右的钩编螺旋体被凝集，尚有50%菌体游离： d）十：25%左右的钩端螺旋体被凝集，尚有75%菌体游离； e）一：全部菌体正常，分散，无凝集块，菌数与对照相同。
待检血清凝集效价在1120达到”十十"或以上时，均判为阳性反应。
6.2酶联免疫吸附试验（ELISA） 6.2.1包被抗原 根据滴定的最适工作浓度，将抗原用包被液稀释。
每孔100pL，置37C1h后再4C过夜。
6.2.2用洗涤液洗3次，每次5min，即干。
6.2.3加样 待检血清和阴性、阳性血清分别用稀释液做1：160稀释，每孔100uL.37C1h，洗涤同上。
6.2.4加酶结合物 用稀释液将酵结合物稀释至适当浓度，每孔加人100L.37C1h-洗涤同上。
6.2.5加底物溶液 每孔加人新配制的底物溶液100L，置37C，避光显色10min~15min。
6.2.6终止反应 每孔加人终止液50pl。
6.2.7测A值 在酶标仪上，于490nm处读出各孔A值。
6.2.8结果判定 在阴性和阳性血清对照成立的条件下，进行结果判定。
6.2.8.1同时符合下列2个条件者，判为阳性： a）待检血清的A值大于等于0.2； b）待检血清的A值/阴性对照血清的A值大于等于2.1。
6.2.8.2均不符合上述2个条件者，判为阴性。
6.2.8.3仅有1条符合者，判为可疑，需重试。
如仍为阳性则判为阳性。
6.2.8.4对阳性结果需重试，如仍为阳性则判为阳性。
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