中华人民共和国国家标准
GB/T15399-2018 代替GB/T153991994
Determination of sulfur amino acids infeeds-Ion exchange chromatography
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准代替GB/T15399-1994《饲料中含硫氨基酸测定方法离子交换色谱法》.本标准与GB/T15399-1994相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：
范围中适用对象增加了精料补充料并增加了方法的定量限（见第1章）；修改了原理的表述（见第3章，1994年版的第3章）；过甲酸氧化溶液中添加了苯酯（见4.5.1994年版的4.1）：偏重亚硫酸钠作终止剂水解时给出警示（见7.1.2）：修改了试验数据处理中的计算公式（见第8章）：增加了氨基酸混合标准溶液的色谱图（见附录A）.
本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心（北京）、通威股份有限公司.
本标准主要起草人：赵根龙、贾铮、李兰、宋军、赵艳、张风秤.
本标准所代替标准历次版本发布情况：
GB/T 153991994.
饲料中含硫氨基酸的测定 离子交换色谱法
1范围
本标准规定了饲料中含硫氨基酸（蛋氨酸、胱氨酸和半胱氨酸）的离子交换色谱法测定法.胱氨酸（含半胱氨酸）和蛋氨酸的定量限均为0.01%. 本标准适用于何料原料、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中含硫氨基酸的测定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6439何料中水溶性氯化物的测定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备 GB/T14699.1饲料采样JG1064氨基酸分析仪
3原理
饲料中的含硫氨基酸用过甲酸氧化和盐酸溶液水解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸祺，经离子交换色谐法分离，带三酮柱后衍生，分光光度法检测，外标法定量.
4试剂或材料
除特殊说明外，所用试剂均为分析纯.
4.1水：应符合GB/T6682中一级用水的规定.
4.2盐酸：优级纯.
4.3甲酸：浓度为88%.
4.4氢氧化钠：优级纯.
4.5过甲酸溶液I：将过氧化氢甲酸=19，混合，并按每毫升添加5mg比例加人苯酚，于室温下放置1h，置冰水浴中冷却30 min.临用现配.
4.7过甲酸溶液Ⅲ：在过甲酸溶液I（4.5）中加人适量硝酸银，每毫升添加量按式（1）计算：
式中：
C样品中氯化钠含量，%：
mx--每毫升过甲酸中硝酸银的量，单位为毫克（mg）；
m-样品质量，单位为毫克（mg）.
GB/T 15399-2018
4.8盐酸溶液（6mol/L)：量取盐酸（4.2）500mL，用水稀释至1000mL，混匀.4.9盐酸溶液（6.8mol/L）：量取盐酸（4.2)1133mL用水稀释至2000mL，混匀.4.10氢氧化钠溶液（7.5mol/L）：取氢氧化钠30g.加水溶解并定容至100mL，4.11柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸三钠19.6g，用水溶解后加人盐酸16.5mL.硫二甘醇5.0mL，苯酚1 g，最后加水定容至1000mL，过滤.4.12偏重亚硫酸钠溶液：称取33.6g偏重亚硫酸钠加水溶解并定容至100mL4.13洗脱用柠檬酸钠缓冲溶液：按仪器说明书配制或购买. 4.14带三酮溶液：取带三酮适量，按仅器说明书配制或购买.4.15磺基丙氨酸-蛋氨酸砜标准贮备液：准确称取磺基丙氨酸（纯度≥99.0%）105.7mg和蛋氨酸矾有效期1年.4.16氨基酸标准储备液：含17种常规蛋白水解液分析用氨基酸（天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸和精氨酸），各组分浓度均为2.50umol/mL，应使用有证标准溶液. 4.17混合氨基酸标准工作液：吸取磺基丙氨酸-蛋氨酸标准贮备液（4.15）和氨基酸标准贮备液（4.16）各1.00mL置于50mL容量瓶中，加柠檬酸钠缓冲液（4.11）定容，混匀.有关各组分浓度均为50nmol/mL 2℃C~8C保存，有效期3个月.
5仅器设备
5.1氨基酸自动分析仅：具有阳离子交换柱、三酮柱后衍生装置及570nm和440nm光度检测器.5.2分析天平：感量0.1mg和0.01mg.5.3喷灯.5.4旋转蒸发器或浓缩器：可在室温至65C间调温，控温精度士1C，真空度可低至3.3×10Pa(25 mm Hg).5.5恒温干燥箱：温度可达110℃土2℃.
6样品
按GB/T14699.1采集有代表性的样品，按GB/T20195进行样品制备.粉碎过0.25mm孔径筛，混合均匀，装人密闭容器备用.
浓缩饲料应首先按GB/T6439测定其NaC1含量.
7试验步骤
7.1氧化和水解
平行做两份试验，称取试样50mg~75mg（约含蛋白质7.5mg~25mg，精确至0.1mg），置于20mL试管中，于冰水浴中冷却30min后加人已冷却的过甲酸溶液1（4.5），如样品是浓缩饲料，视其氯化钠含量加过甲酸溶液[氯化钠含量小于等于3%的加人过甲酸溶液Ⅱ（4.6），氯化钠含量大于3%加人过甲酸溶液Ⅲ（4.7）2ml，加液时需将样品全部润湿，但不要摇动，盖好瓶塞，连同冰浴一道置于 2
0℃~4℃冰箱中，反应16h.
以下步骤依使用不同的氧化终止剂而不同：
a）若以氢溴酸为终止剂：于各管中加人氢澳酸0.3mL振摇，放回冰浴，静置30min，然后移到旋转蒸发器或浓缩器（5.4）上，在60C低于3.3×10²Pa（25mmHg）下浓缩至干.用盐酸溶液（4.8）约15mL将残渣定量转移到20mL安瓶或水解管中，封口或旋紧管盖，置恒温箱中，110℃±2C下水解22h~24 h.滤，取1mL~2mL滤液，置于旋转蒸发器或浓缩器中，在低于50C的条件下，减压蒸发至干. 取出安瓶或水解管，冷却，用水将内容物定量地转移至50mL容量瓶中，定容.充分混匀，过加少许水重复蒸干2次~3次.准确加人一定体积（2mL~5mL）的柠檬酸钠缓冲液（4.11）振摇，充分溶解后离心，取上清液供仪器测定用.b）若以偏重亚硫酸钠为终止剂：则于样品氧化液中加人偏重亚硫酸钠溶液（4.12）0.5mL，充分摇匀后，直接加人盐酸溶液（4.9）17.5mL置110℃土2C恒温箱中水解，水解22h~24h.警示一一在水解开始时，不要封安部瓶瓶口，或旋动水解管的管精，待水解1h后再封口或旋 紧管帽，否则容易引起水解管爆裂，取出安瓶或水解管，冷却，用水将内容物转移到50mL容量瓶中，用氢氧化钠溶液（4.10）中和至pH约2.2，并用稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.11)定容，离心，取上清液供仪器测定用.注：有些氨基酸分析仪，上机试样溶液的Na”浓度会影响色谐峰出峰时间或氨基酸的分离.对此需先将水解液定容过滤，取2mL~5ml.滤液，于50℃下，减压蒸发至约0 5mL（切勿蒸干）.用稀释上机用柠橡酸钠缓冲液（4.11)将其转移至10mL容量瓶中•加氢氧化钠溶液（4.10）调至pH2.2-并用稀释缓冲液（4.11）定
容.混匀，离心，取上清液供仪器测定用.
7.2测定
用缓冲溶液试剂配比应符合JG1064氨基酸分析仪检定规程的要求并保证蛋氨酸矾与天门冬氨酸的 使用混合氨基酸标准工作液（4.17）注人氨基酸自动分析仪，适当调整仪器操作程序及参数和洗脱分辨率大于85%，其标准溶液色谱图参照附录A的图A.1.测定中每5个样品（即10个单样）为一组，组间插人混合氨基酸标准工作液（4.17）进行校准.以保留时间定性，单点外标法定量.试样中氨基酸的峰面积应在相应标准工作液该峰面积的30%～200%之间，否则应用柠橡酸钠缓冲液（4.11）稀释后重测.
8试验数据处理
试样中胱氨酸（蛋氨酸）含量以其质量分数w表示，数值以克每100克表示，按式（2）计算：
式中：
A--试样溶液中磺基丙氨酸（蛋氨酸矾）的峰面积；V-试样水解液体积，单位为毫升（mL）；（--标准工作液中磺基丙氨酸（蛋氨酸矾）浓度，单位为纳摩尔每毫升（nmol/mL)；V.-试样溶液进样体积，单位为微升（pl）；n试样水解液稀释倍数； V.氨基酸标准溶液进样体积，单位为微升（μL）；
