中华人民共和国国家标准
GB/T 15670.19-2017
农药登记毒理学试验方法 第19部分：体外哺乳动物细胞染色体 畸变试验
Toxicological test methods for pesticides registrationPart 19:In vitro mammalian cells chromosome aberration test
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则：第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法： 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验：第6部分：急性吸人毒性试验：第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验： -第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验：第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验；第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验：第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验； 第13部分：亚慢性毒性试验；第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；一第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：嘀齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；一第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验； 一第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；-第23部分：致畸试验：第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验； 第27部分：致癌试验；第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；-第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第19部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所，本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、陶传江.
农药登记毒理学试验方法 第19部分：体外哺乳动物细胞染色体 畸变试验
1范围
本部分适用于为农药登记而进行的体外哺乳动物细胞染色体畸变试验. GB/T15670的本部分规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、方法和要求.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T15670.14-2017农药登记毒理学试验方法第14部分：细菌回复突变试验
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
结构畸变structuralaberration
可分为染色体型畸变（chromosome-typeaberration）和染色单体型畸变（chromatid-type aberration） 在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等.结构畸变两类.
3.2
染色单体型畸变chromatid-type aberration
染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤.
染色体结构损伤，表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的改变.
有丝分裂指数mitoticindex
中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值，是一项反映细胞增殖程度的指标.
3.5
多倍体polyploidy
体、四倍体等. 哺乳动物细胞染色体数目正常为二倍体，在化学诱变剂的作用下染色体数目成倍地增加，如三倍
4试验目的
本试验检测受试物是否引起培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性.
5试验概述
在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中.用中期分裂相体畸变. 阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色
大部分的致突变剂导致染色单体型畸变，偶有染色体型畸变发生.虽然多倍体的增加可能预示着有染色体数目畸变的可能，但本方法并不适合用于测定染色体的数目畸变.
6试验方法
6.1受试物和试剂
6.1.1受试物的配制
固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加人试验系统和/或用前稀释至适合浓度.受试物应在使用前新鲜配制，否则就必须证实贮存不影响其稳定性.溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性.首选溶剂是培养液（不含血清）或水，二甲基亚矾（DMSO）也是常用溶剂，使用时浓度不应大于0.5%.
6.1.2剂量设计
6.1.2.1最高浓度的选择
决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗透压（osmolality）的改变.
细胞毒性的确定应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在的两种条件指数（mitotic index）.应在预试验中确定细胞毒性和溶解度. 下确定细胞毒性，例如细胞覆盖程度（degree of confluency）、活细胞数（viable cell counts）或有丝分裂
6.1.2.2试验剂量
至少应设置3个可供分析的浓度.当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从最大毒性至儿乎无毒性：浓度间隔系数通常介于2~√10之间.
在收获细胞时，最高浓度应能明显降低细胞覆盖程度、细胞计数或有丝分裂指数（均应大于50%）.
对于相对无细胞毒性的化合物，最高浓度应是5uL/mL，5mg/mL或0.01mol/L.
对于相对不溶的受试物，在接近不溶解浓度时仍无细胞毒性，则最高剂量应采用染毒结束时的最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度，在某些情况下（如细胞毒性仅发生在高于最低不溶解浓度水平），应设一个以上可见沉淀的浓度.
6.1.3对照物
6.1.3.1阳性对照物
可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果.不需要外源性代谢活化系统的阳性物有甲磺酸甲酯（methylmethanesulfon（mitomycin C)、4-硝基喹-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）.需要外源性代谢活化系统的阳性 ate，MMS）、甲磺酸乙酯（ethylmethanesulfonate，EMS）、乙基亚硝基脲（ethy]nitrosourea）、丝裂霉素C2
物有苯并（a）芘[benzo（a）pyrene]、环磷酰胺（cyclophosphamide）.
6.1.3.2阴性对照物
应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其他处理和受试物组完全相同.如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白 对照.
6.1.4培养液
采用Eagle氏最低必需培养基（minimalessentialmedium，Eagle），并加入非必需氨基酸和抗菌素（青、链霉素，按100IU/mL），胎牛血清或小牛血清按10%加人.也可选用其他合适的培养液.
6.1.5活化系统
通常使用的是S9混合物（S9mix）.S9是从经酶诱导剂处理的喘齿动物肝脏获得的.S9的制备见GB/T15670.14-2017的5.7.S9的使用浓度为1%~10%（终浓度）.S9mix中所加辅助因子的量由各实验室自行决定，但需对S9mix的活性进行鉴定，应能明显活化阳性对照物，也可使用下述配方：
S9 0.125 mLMgCl; (0.4 mol/L) 0.02 mLKC1(1.65 mol/L) 0.02 mL葡萄糖-6-磷酸 辅酶Ⅱ（氧化型，NADP) 1.791 mg 3.061 5 mg用无血清MEM培养液补足至1mL.
6.2试验步骤
6.2.1细胞：可使用已建立的细胞株或细胞系，也可使用原代培养细胞.所使用的细胞应该在生长性 能、染色体数目和核型、自发的染色体畸变率等方面有一定的稳定性，推荐使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞株、中国仓鼠肺（CHL）细胞株、人或其他喵乳动物外周血淋巴细胞.
6.2.2试验时，应同时设阳性对照组、阴性对照组和至少3个可供分析的受试物浓度组.
6.2.3试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养Ⅲ（瓶）中，置于（0：培养箱内培养.
6.2.4试验需在加入和不加人S9mix的条件下进行.试验时，吸去培养Ⅲ（瓶）中的培养液，加人一定处理3h~6h.结束后，吸去含受试物的培养液，用Hanks液洗细胞3次，加人含10%胎牛血清的培养液，放回培养箱，于24h内收获细胞.收获前2h~4h，加人细胞分裂中期阻断剂（如用秋水仙素，作用时间为4h，终浓度为1μg/mL).
当难以得出明确结论时，应更换试验条件，如改变代谢活化条件、受试物与试验系统接触时间等重复试验.
6.2.5收获细胞时，用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱落后，加人含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以1000r/min~1200r/min的速度离心5min~7min，弃去上清液，加人0.075mol/LKC1溶液低渗处理继面以新配制的甲醇和冰乙酸液（容积比为3：1)进 行固定.空气干燥或火焰干燥法常规制片，用姬娜萨染液（pH值6.8~7.0）染色.
6.2.6作染色体分析时，每一处理组分析200个中期分裂相细胞（阳性对照可分析100个中期分裂相细胞）.在分析时应记录每一观察细胞的染色体数目，对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型，结果均用百分比表示.
