GB/T 17999.3-2008
前言
GB/T17999《SPF鸡微生物学监测》分为10个部分： 第1部分：SPF鸡微生物学监测总则； 第2部分：SPF鸡红细胞凝集抑制试验： -第3部分：SPF鸡血清中和试验； -第4部分：SPF鸡血清平板凝集试验； 第5部分：SPF鸡琼脂扩散试验； 一第6部分：SPF鸡酵联免疫吸附试验： 一第7部分：SPF鸡胚敏感试验： -第8部分：SPF鸡鸡白痢沙门氏菌检验； 第9部分：SPF鸡试管凝集试验： 一第10部分：SPF鸡间接免疫荧光试验。
本部分为GB/T17999的第3部分。
本部分修订参照（IE（陆生动物（哺乳动物、禽鸟和蜜蜂）诊断试验和疫苗手册》（第五版）中的有关 规定。
本部分代替GB/T17999.2-1999（SPF鸡血清中和试验》 本部分与GB/T17999.2-1999相比主要变化如下： 增加了规范性附录A"试剂的配制”、资料性附录B"病毒接种技术”以及资料性附录C"鸡胚接 种病毒后的病变特征”； 一在试验内容部分，增加了病毒的稀释梯度； 一对不同病毒致死鸡胚的时间重新确定。
本部分附录A为规范性附录，附录B、附录C为资料性附录。
本部分由中华人民共和国农业部提出。
本部分由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。
本部分起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心、济南斯帕法 斯家禽有限公司。
本部分主要起草人：曲连东、刘家森、韩凌霞、邵卫星、朱果、单忠芳、姜骞、司昌德、于海波、孟庆文。
本部分所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T 17999. 21999
GB/T 17999. 3-2008
SPF鸡微生物学监测 第3部分：SPF鸡血清中和试验
1范围 GB/T17999的本部分规定了血清中和试验的技术要求。
本部分适用于对SPF鸡进行以下病毒中和抗体的检测：禽脑脊髓炎病毒（Avian Encephalomyelitis Virus）、传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus）、传染性喉气管炎病毒（Infectious Laryngo tracheitis Virus）、传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus)。
2原理 中和试验系指有生物活性的病毒与相应的抗体结合后，失去原有的生物活性的中和反应。
中和反 应不仅有高度特异性，且具有严格的量的关系。
因此可用中和试验鉴定病毒，也可用于相应抗体的定量 检测。
3试剂和器材 3.1试剂 3.1.1病毒：禽脑脊髓炎病毒VanRoekel株（CVCCAV35）、传染性支气管炎病毒H52（CVCC AV1513）、传染性法氏囊病病毒A80株（CVCVAV2321）、传染性喉气管炎病毒A96（CVCCAV200）。
3.1.2病毒稀释液：胰蛋白陈磷酸盐肉汤（见附录A）。
3.1.3青霉素/链霉素（双抗）液（见附录A）. 3.1.43%碘配溶液。
3.1.5SPF胚蛋。
3.2器材 3.2.1蛋钻（打孔器）。
3.2.26号针头， 3.2.37号针头。
3.2.4混合器. 3.2.5照蛋器. 4操作程序 4.1试验准备 4.1.1血清样品处理
4.1.2SPF胚蛋准备 照胚检查胚体活力，选取血管清晰、胚体规律摆动的健康胚蛋，每个检测项目需胚蛋24枚。
4.1.3稀释病毒 4.1.3.1取灭菌试管4支~9支，每管加人稀释液4mL、青霉素/链霉素液0.5mL. 4.1.3.2第1管加人病毒液0.5mL，作连续10倍稀释。
各种病毒的稀释度参见表1。
GB/T 17999.3-2008
表1病毒稀释 病毒稀释度 禽脑音髓炎病毒0[~_0[ 传染性支气管炎病毒0[~0[ 传染性法氏囊病病毒10~1 ~10 传染性联气管炎病毒0[~0[ 4.2中和试验 4.2.1血清准备 每份被检血清需1.5mL。
4.2.2病毒稀释度选择 根据具体情况决定，一般选择6个连续的病毒稀释度。
检测SPF鸡血清样品时，病毒采用较高稀 释度，如10-~10°。
检测阳性对照血清样品时，病毒采用较低稀释度，如10-~10。
检测普通鸡血 清样品时，病毒稀释度常采用10-~10-” 4.2.3病毒与血清混合感作 将血清与不同稀释度的病毒等体积混合后，经37C感作，感作时间见表2。
表2血清与病毒混合感作时间 病感作时间/min 禽脑音髓炎病毒60 传染性支气管炎病毒30或 60 传染性法氏囊病病毒60 传染性喉气管炎病毒45 4.2.4接种鸡胚 4.2.4.1病毒与血清混合感作后接种鸡胚，每个稀释度接种4枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.2mL。
4.2.4.2病毒对照：将不同稀释度的病毒液，分别接种鸡胚，每个稀释度接种4枚鸡胚，每枚鸡胚接 0.1 mL. 4.2.4.3接种：根据病毒种类选择接种方法（见表3）。
表3病毒接种胚龄与方法 病毒种类胚龄/d接种方法 禽脑脊髓炎病毒5~7YS 传染性支气管炎病毒0[~6 传染性法氏囊病病毒10CAM 传染性哦气管炎病毒0[~6CAS 注：YS-黄囊：CAS尿囊腔：CAM绒毛尿囊膜（接种方法参见附录B）。
4.2.5孵化 将接种后的鸡胚放入孵化器，继续孵化。
根据病毒不同，选定不同的孵化时间（见表4）。
2
GB/T 17999.3-2008 表4接种鸡胚的孵化时间 病毒孵化时间/d 禽脑脊髓炎病毒10~12 传染性支气管炎病毒8 传染性法氏囊病病毒 传染性喉气管炎病毒 4.2.6观察和记录 每日照胚，记录各组鸡胚的死亡数（24h内死亡的鸡胚忽略不计）；孵化期满，记录各组鸡胚的感染 数（参照附录C中的描述进行判定）。
4.2.7计算中和指数 4.2.7.1统计原理 结果以中和指数表示，中和指数表示被检血清中有无中和抗体及中和病毒的能力。
为求中和指数， 应计算出病毒对照和被检血清/病毒的ELD，此二者的差数即为中和指数（Reed和Muench法），参见 示例。
示例： 病毒对照组及血清/病毒试验组死亡情况见表5和表6。
表5病毒对照组死亡情况 病毒稀释度死亡比例死亡存语累计
死亡存话死亡比例死亡百分率/% 10~4//13100, 0 104/440909/9100,0 10-2/422525/771. 4 10-2/42233/742.8 10-91/41371/812,5 10-0/404110/110 注：分母表示接种鸡胚数，分子表示因病毒感染死亡鸡胚数（表6同）。
表6血清/病毒组死亡情况 病毒稀释度死亡比例死亡存语累计
死亡存活死亡比例死亡百分率/% 104//17100 10-4/401313/13100 10-4/440909/9100 103/431515/683,3 10-2/422232/540 10-90/4000/50 4.2.7.2中和指数计算 被检血清的中和指数为病毒对照组ELD效价与血清/病毒组ELD效价的差值， ELD效价为高于50%死亡的病毒稀释度倒数的对数与距离比之和，其中距离比按式（1）计算。
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