GB/T 186252002
前言
本标准在制定过程中主要参考了以下标准： 美国公职分析化学师协会AOAC1229.049-29.055《食品中有机磷农药残留测定-胆碱酯酶抑 制法》。
本标准的附录A是规范性附录。
本标准由辽宁省质量技术监督局提出。
本标准由沈阳农业大学、沈阳市质量技术监督局苏家屯分局负责起草。
本标准主要起草人：周艳明、高淑英、张会娟、王晓光、李亮亮、吴小琳、牛森。
GB/T 186252002
茶中有机磷及氨基甲酸酯农药 残留量的简易检验方法酶抑制法
1范围 本标准规定了用酶抑制法测定茶中有机磷农药及氨基甲酸酯农药残留的简易检验方法。
本标准适用于茶中有机磷农药及氨基甲酸酯农药残留的测定。
2原理 有机磷农药及氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的活性有抑制作用，在一定条件下，其抑制率取决于农 药种类及其含量。
在pH8的溶液中，碘化硫代乙酰胆碱被胆碱酯酶水解，生成硫代胆碱。
硫代胆碱具有还原性，能使 蓝色的2.6-二氯酚褪色，褪色程度与胆碱酯酶活性正相关，可在600nm比色测定，酶活性愈高时，吸 光度值愈低。
当样品提取液中有一定量的有机磷农药或氨基甲酸酯类农药存在时，酶活性受到抑制，吸 光度值则较高。
据此可判断样品中有机磷农药或氨基甲酸酯类农药的残留情况。
样品提取液用氧化剂 氧化，可提高某些有机磷农药的抑制率，因而可提高其测定灵缴度，过量的氧化剂再用还原剂还原，以免 干扰测定。
3试剂 3.1底物溶液：2%碘化硫代乙酰胆碱水溶液，1g碘化硫代乙酰胆碱，加缓冲液溶解并定容至50mL。
3.2缓冲液 pH8的三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲液：50mL0.1mol/LTris加 29.2 mL0.1mol/L盐酸 加水定容至100ml。
3.3显色剂：0.04%2.6-二氧靛酚水溶液。
3.4氧化剂：0.5%次氯酸钙水溶液。
3.5还原剂：10%亚硝酸钠水溶液。
3.6胆碱酯酶液：0.2g酶粉（其制备方法见附录A）加10mL.缓冲液溶解。
3.7脱色剂：活性炭。
3.8丙酮：分析纯。
3.9碳酸钙：分析纯。
4仪器 分光光度计， 5分析步骤 5.1样品提取 取0.5g茶置于10ml.烧杯中，加5mL丙酮浸泡5min，不时振摇，再加0.2g碳酸钙。
注：以上操作应在15~35C温度下进行，
GB/T 18625-2002 5.2氧化 放置10min。
再加人还原剂0.3mL，摇匀。
测定。
5.4测定 分光光度计波长调至600nm，其他按常规操作，读取测定值。
6结果 6.1测定结果的使用 当测定值在1.0以下时，为未检出。
当测定值在1.0~1.3之间时，为可能检出，但残留量较低。
当测定值为1.3以上时，为检出。
测定值与农药残留量正相关，测定值越高时，说明农药残留量越高。
6.2方法最低检出浓度 本方法最低检出浓度见表1。
表1最低检出浓度单位为毫克每于克 农药最低检出浓度农药最低检出涨度 敌敬畏2.0对硫磷10.0 甲基对硫磷3-0敌百虫2-0 乐果3.0氧化乐果1-0 辛硫磷3-0伏杀酶1-5 内吸磷1-0甲胺磷20 乙酰甲胺磷2.0二嗪磷5-0 唤暗丹4.0西潍因2.0 抗蚜成1-2
GB/T 186252002
附录A （规范性附录） 胆碱酯酶粉的制备 A.1试剂 A.1.10.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液 0.1mol/L磷酸氢二钠溶液：17.56g磷酸氢二钠（NaHPO2HO）溶于1000mL水中。
0.1mol/L磷酸二氢钠溶液：13.80g磷酸二氢钠（NaHPO，2HO）溶于1000mL水中。
将12.3ml.0.1mol/L磷酸氢二钠溶液与87.7mL.0.1mol/L磷酸二氢钠溶液混合，即为 0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液， A.1.20.005mol/LpH6.0磷酸缓冲液 取50mL0.1 mol/1.pH6.0磷酸缓冲液（A.1.1)，加水稀释至1 000mL。
A.1.30.5mol/1.氢氧化钠-0.5mol/L氯化钠溶液 1.0mol/L.氢氧化钠溶液：取40g氢氧化钠溶于1000ml.水中。
1.0mol/L.氯化钠溶液：取58.5g氯化钠溶于1000mL水中。
将上两液1：1混合，即得0.5mol/1.氢氧化钠-0.5mol/L氯化钠溶液。
A.1.40.5mol/L盐酸-0.5mol/L氯化钠溶液 1.0mol/L盐酸溶液：取83.33ml.浓盐酸溶于1000ml水中。
将1.0mol/L.盐酸溶液与1.0mol/L氯化钠溶液1:1混合，即得0.5mol/1.盐酸-0.5mol/L氯化 钠溶液。
A.1.5羧甲基纤维素（CM-纤维素）干粉 A.2装置 A.2.1梯度混合器：两瓶连通式，每瓶容量200ml。
A.2.2柱层析系统：1.5×40cm玻璃层析柱流量可达2mL/min蝠动泵。
A.2-3冷冻干燥机。
A.3程序 A.3.1羧甲基纤维素的处理 取10g羧甲基纤维素（CM-纤维素）干粉置于烧杯中.加入100mL0.5mol/L.氢氧化钠- 0.5mol/L氯化钠溶液，混匀，静置15min后，用布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。
将此滤饼再悬浮于 100mL.1mol/L盐酸溶液中，混匀，静置10min后再用布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。
再将滤饼悬浮 于100mL0.5mol/L.盐酸-0.5mol/1.氯化钠溶液中.混匀，静置15min后用布氏漏斗抽滤，水洗滤饼 至中性。
将滤饼悬浮于0.005mol/LpH6.0磷酸缓冲液（A.1.2）中。
A.3-2胆碱酯酶的提取 取50g新鲜食用面粉置三角瓶中.加250mL蒸馏水，振荡30min。
静置30min以上，取上清液经5000r/min离心20min。
收集土清液用冷冻干燥机浓缩至20mL.左右，为胆碱酯酶粗提被，保存于冰箱中待纯化。
A.3-3胆碱酯酶粗提液的纯化 将处理好的羧甲基纤维素悬浮液加入层析柱中.加150mL.0.005mol/L.pH6.0磷酸缓冲液...
