中华人民共和国国家标准
GB/T18932.8-2002
Method for the determination of erythromycin residues in honeyCylinderplatemethod
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
GB/T18932-2002分为12个部分，本部分为第8部分.GB/T18932的本部分遵循GB/T20001.4-2001（标准编写规则第4部分：化学分析方法》的编写规则.本部分的附录A是规范性附录，附录B和附录C是资料性附录. 本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出.本部分由中华全国供销合作总社归口.本部分起草单位：中华人民共和国泰皇岛出入境检验检疫局.本部分主要起草人：庞国芳、付宝莲、林忠.
本部分系首次发布的国家标准.
蜂蜜中红霉素残留量的测定方法 杯碟法
1范围
GB/T18932的本部分规定了蜂蜜中红霉素残留量的杯测定方法.本部分适用于各种蜂蜜中红霉素残留量的测定. 本部分红霉素的方法检出限为0.05mg/kg.
2规范性引用文件
件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 下列文件中的条款通过GB/T18932的本部分的引用而成为本部分的条款.凡是注日期的引用文协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分.
GB/T6379-1986测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重复性和再现性(neg ISO 5725 :1981)
GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法（neqISO3696：1987）
3原理
试样中残留的红霉素经甲醇溶解后，在碱性条件下用三氯甲烷提取，提取液经浓缩并溶解后，利用杯碟法进行检测，并用红霉素标准曲线进行定量.
4试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682-1992中规定的三级水.
4.1试剂
枯草芽孢杆菌（Bacilus subtilis）.菌种号（China MicrobialCulture Collection）CMCC（B)63501.
4.3标准物质
红霉素.9231U/mg或相当者.
4.4工作溶液的配制
4.4.2磷酸氢二钠溶液：10g/L.称取10.0g磷酸氢二钠，溶解于水中并定容至1000mL. 4.4.1氢氧化钠溶液：1mol/L.称取40.0g氢氧化钠，溶解于水中并定容至1000ml.4.4.3磷酸盐缓冲溶液：pH8.0.称取16.73g无水磷酸氢二钾，0.53g无水磷酸二氢钾，溶解于水中并定容至1000mL.
GB/T 18932.8-2002
4.4.4生理盐水：8.5g/L.称取8.5g氯化钠，溶解于1000mL水中，121C高压灭菌20min.
4.5标准溶液的配制
溶解并定容浓度为1000ug/mL（按效价换算）的标准储备溶液.4C保存，贮存期限一周. 4.5.1红霉素标准储备溶液：准确称取（精确至0.1mg）适量的红霉素标准物质（4.3），用甲醇（4.1.1）4.5.2红霉素标准工作溶液：取标准储备溶液（4.5.1）用磷酸盐缓冲溶液（4.4.3）稀释，配制成浓度为0.05、0.10、0.200.40和0.80pg/mL的标准工作溶液.当天配制，当天使用.
4.6.1培养基1：见第A.1章. 4.6.2培养基2：见第A.2章.4.6.3培养基3：见第A.3章.4.6.3培养基3：见附录A中A.3.
（4.6.2）的斜面上，置（35土1）C培养7d，镜检芽孢在85%以上后，用10mL生理盐水（4.4.4）洗下菌 将试验菌种（4.2）接种于培养基1内（4.6.1），经（35士1）C培养18h~24h后，再转种于培养基2苔，于65C水浴30min后，离心（3000r/min）20min，弃去上清液.再加10mL生理盐水，重复离心步骤两次.最终用10mL生理盐水制成芽孢菌悬液.4C保存，贮存期限一个月.
5收器
5.1均质器：转速不低于5.000r/min.5.2离心机：转速不低于4000r/min.5.3旋转蒸发器.5.4恒温水浴锅. 5.5生化培养箱：（35士1）C.5.6高压灭菌器.5.7培养Ⅲ：内径90mm.底部平整光滑的玻璃Ⅲ或塑料Ⅲ，具陶瓦盖.5.8牛津杯：不锈钢小管，外径（8.0±0.1）mm，内径（6.0±0.1）mm，高度（10.0±0.1）mm 5.9游标卡尺：测量范围0mm~200mm.精度土0.02mm
6试样的制备与保存
7测定步骤
7.1提取
称取10g试样，精确到0.01g置于50mL离心管中，用2×20mL甲醇（4.1.1）均质1min（4 000r/min）后离心20min（4 000r/min）.合并两次离心的上清液于200mL分液漏斗中.
7.2净化
7.2.1甲醇萃取
在上述上清液（7.1）中加入20mL正已烷（4.1.2）充分振荡1min，静置分层，将下层的甲醇相移人另一200mL的分液漏斗中.
7.2.2三氯甲烷萃取
在上述甲醇相（7.2.1）中加人2mL氢氧化钠溶液（4.4.1）和30mL三氧甲烷（4.1.3）充分振荡1min，再加入30mL磷酸氢二钠溶液（4.4.2）.振荡1min，静置15min~20min.将三氯甲烷相移人的旋转蒸发器上蒸发至干.加人5mL磷酸盐缓冲溶液（4.4.3）溶解残渣.此溶液含试样量为 50mL的容量瓶中，并用三氯甲烷定容至刻度，混匀.量取其中25mL于150mL鸡心瓶中，在40C水浴1. 0 g/mL
7.3测定
7.3.1菌悬液用量的测定
浓度的红霉素标准工作溶液（4.5.2）产生直径大于10mm、清晰、完整的抑菌圈为最适菌悬液用量. 在实际测定前，将不同浓度的菌悬液（4.7）加入定量的培养基3（4.6.3）中培养，能使0.05μg/mL
7.3.2检定用平板的制备
将从7.3.1测试所得的最适菌悬液用量加人已溶化并冷至55C左右的培养基3（4.6.3）中，充分混匀并立即倾注在灭菌培养Ⅲ中，每平Ⅲ加人量为9.0mL.置水平台上凝固后，在每个检定用平板中放置六个牛津杯，使每个牛津杯在半径为2.8cm的圆面成60角间距.所用平板应当天制备.
7.3.3标准曲线的制备
红霉素标准工作溶液（4.5.2）0.80、0.40、0.20、0.10和0 05μg/mL五个浓度中，0.20μg/mL标准工作溶液为参考浓度.
12个检定用平板.每个检定用平板中的三个牛津杯内注满参考浓度（0.20ug/mL）标准工作溶液，另 每个红霉素标准工作溶液浓度除参考浓度（0.20μg/mL）外，各取三个检定用平板为一组，四组共三个牛津杯中则分别注满其他浓度的标准工作溶液.这样参考浓度（0.20μg/mL）标准工作溶液将得出36个抑菌圈直径读数的数据，其他浓度标准工作溶液将各得九个抑菌图直径读数的数据.
盖好陶瓦盖，置（35士1）C培养18h士1h后取出，翻转平板，除去牛津杯，执游标卡尺准确地测量各径读数的平均值以及参考浓度（0.20pg/mL）36个抑菌圈直径读数的总平均值，用参考浓度 抑菌图直径（精确到o.1mm），求出各组平板中标准工作溶液浓度及参考浓度（0.20μg/mL）抑菌图直（0.20μg/mL）的总平均值减去各组参考浓度（0.20μg/mL）的平均值之差为校正值，以此值校正其他各浓度标准工作溶液以及被测样品溶液抑菌图直径读数的平均值.
将各组校正值代人式（1）和式（2）中，求出L和H值后，在半对数坐标上，以抑菌圈直径（mm）为纵坐标（算术级），以标准工作溶液浓度（μg/mL）为横坐标（对数级），标出L和H点，连一直线，即为标准 曲线.
式中：
L-标准曲线上最低浓度（0.05pg/mL）的抑菌图直径，单位为毫米（mm）；H-标准曲线上最高浓度（0.80μg/mL）的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）；α、b、d、e分别表示标准曲线中其他各浓度标准工作溶液（0.05、0.100.40、0.80pg/mL）抑菌图直 （-参考浓度（0.20μg/mL）抑菌图直径的总平均值，单位为毫米（mm）；
径数据的校正值，单位为毫米（mm）.
7.3.4样品溶液的测定
每份样品溶液各用三个检定平板.按7.3.3标准曲线制备的要求放置牛津杯，各平板中的三个牛好，（35士1）C培养18h士1h后，翻转平板，除去牛津杯，执游标卡尺准确地测量抑菌圈直径（精确到 津杯中注满参考浓度（0.20μg/mL）标准工作溶液，另三个牛津杯中则注满被测样品溶液.将陶瓦盖盖0.1mm）.分别求出被测样品溶液及参考浓度抑菌图直径读数的平均值.
