中华人民共和国国家标准
GB/T 18932.9-2002
蜂蜜中青霉素残留量的测定方法 杯 碟 法
Method for the determination of penicillin residues in honeyCylinder platemethod
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
GB/T18932-2002分为12个部分，本部分为第9部分.GB/T18932的本部分遵循GB/T20001.4-2001标准编写规则第4部分：化学分析方法3的编写规则. 本部分的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录.本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出.本部分由中华全国供销合作总社归口.本部分起草单位：中华人民共和国泰皇岛出入境检验检疫局.本部分主要起草人：庞国芳、付宝莲、林忠. 本部分系首次发布的国家标准.
蜂蜜中青霉素残留量的测定方法 杯碟法
1范围
GB/T18932的本部分规定了蜂蜜中青霉素残留量的杯碟测定方法.本部分适用于各种蜂蜜中青霉素残留量的测定. 本部分青霉素的方法检出限为0.025mg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T18932的本部分的引用而成为本部分的条款.凡是注日期的引用文协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成部分.
GB/T6379-1986测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重复性和再现性(neq ISO 5725 :1981)
GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法（neqISO3696：1987）
3原理
试样中残留的青霉素经用磷酸盐缓冲液溶解、离心后，取上清液作杯法测定，并用标准曲线进行定量.青霉素酶作确证试验.
4试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682一1992中规定的三级水.
4.1试验菌种
藤黄微球菌（Micrococcux Lateas）.菌种号（China Microbial Culture Collection）CMCC(B)28001.
青霉素钠.1663IU/mg或相当者.
4.3青霉素酶（β-内酰胺酶）
4.4工作溶液的配制
4.4.1磷酸盐缓冲溶液：pH6.0.称取8.0g无水磷酸二氢钾，2.0g无水磷酸氢二钾，溶解于水中并 定容至1000mL 4.4.2生理盐水：8.5g/L.称取8.5g氯化钠，溶解于1000mL水中.121C高压灭菌20min.
4.5标准溶液的配制
4.5.2青霉素标准工作溶液：取标准储备溶液（4.5.1）用磷酸盐缓冲溶液稀释，配制浓度为0.20、 （4.4.1）溶解并定容为1000pg/mL（按效价换算）的标准储备溶液.当天配制，当天使用.0.10、0.05.0.025和0.0125pg/mL的标准工作溶液.当天配制，当天使用.
GB/T 18932.9-2002
4.6培养基
4.6.1培养基1：见第A.1章.4.6.2培养基2：见第A.2章.
4.7菌悬液的制备
将试验菌种（4.1）接种于培养基2（4.6.2）内，经（35土1）C培养18h~24h.取适量培养液转种于培养基1（4.6.1）斜面上，经（35±1）C培养18h~24h.用10mL生理盐水（4.4.2）洗下菌苔即为菌悬液.4C保存，贮存期限2周.
5仪器
5.1均质器：转速不低于5000r/min.5.2离心机：转速不低于4000r/min.5.3生化培养箱：（35土1）C.5.4高压灭菌器. 5.5培养Ⅲ：内径90mm.底部平整光滑的玻璃Ⅲ或塑料Ⅲ，具陶瓦盖，5.6牛津杯：不锈钢小管，外径（8.0±0.1）mm，内径（6.0±0.1）mm，高度（10.0±0.1）mm.5.7游标卡尺：测量范围0mm~200mm，精度±0.02mm.
6试样的制备与保存
6.1样品的制备
将样品搅拌均匀.分出0.5kg作为试样，制备好的试样置于样品瓶中，密封，并加以标识.
6.2试样的保存
将样品于常温下保存.
7测定步骤
7.1提取
称取10g试样，精确至0.01g，置于50mL离心管中.加人20mL磷酸盐缓冲溶液（4.4.1）搅匀，20mL具塞试管中并用磷酸盐缓冲溶液定容至刻度，此溶液含试样量为0.5g/mL. 静置10min.用均质器均质1min（4000r/min）后离心30min（4000r/min）.移取全部上清液到
7.2测定
7.2.1菌悬液用量的测定
0.0125μg/mL浓度的青霉素标准工作溶液产生直径大于10mm、清晰、完整的抑菌图为最适菌悬液 在实际测定前，将不同浓度的菌悬液（4.7）加人定量的培养基1（4.6.1）中培养，能使用量.
7.2.2检定用平板的制备
将从7.2.1所得的最适菌悬液用量加人已溶化并冷至48C~50C左右的培养基1（4.6.1）中，充中放置六个牛津杯，使每个牛津杯在半径为2.8crm的圆面成60角间距.所用平板应当天制备. 分混匀并立即倾注在灭菌培养Ⅲ中，每平Ⅲ加人量为9.0mL.置水平台上凝固后，在每个检定用平板
7.2.3标准曲线的制备
青霉素标准工作溶液（4.5.2）0.20、0.10、0.05、0.025和0.0125μg/mL五个浓度中，0.05μg/mL标准工作溶液为参考浓度，
为一组，四组共12个检定用平板.每个检定用平板中的三个牛津杯内注满参考浓度（0.05μg/mL）标 每个青霉素标准工作溶液（4.5.2）浓度除参考浓度（0.05μg/mL）外，各取三个检定用平板（7.2.2）准工作溶液，另三个牛津杯中则分别注满其他浓度的标准工作溶液.这样参考浓度（0.05μg/mL）标准2
工作溶液将得出36个抑菌圈直径读数的数据，其他浓度标准工作溶液将各得九个抑菌圈直径读数的数据.
各抑菌圈直径（精确到0.1mm），求出各组平板中标准工作溶液浓度及参考浓度（0.05μg/mL），抑菌圈 盖好陶瓦盖，置（35士1）C培养18h士1h后取出，翻转平板，除去牛津杯，执游标卡尺准确地测量直径读数的平均值以及参考浓度（0.05μg/mL），36个抑菌图直径读数的总平均值.用参考浓度（0.05μg/mL）的总平均值减去各组参考浓度（0.05μg/mL）的平均值之差为校正值，以此值校正其他各浓度标准工作溶液及被测样品溶液抑菌圈直径读数的平均值.
标（算术级），以标准工作溶液浓度（μug/mL）为横坐标（对数级），标出L和H点，连一直线，即为标准 将各组校正值代人式（1）和式（2）中，求出L和H值，在半对数坐标上，以抑菌圈直径（mm）为纵坐曲线.
式中：
L-标准曲线上最低浓度（0.0125μg/mL）的抑菌图直径，单位为毫米（mm）；H-标准曲线上最高浓度（0.20μg/mL）的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）；（-参考浓度（0.05pg/mL）抑菌图直径的总平均值，单位为毫米（mm）；α、b、d、e--分别表示标准曲线中其他各浓度标准工作溶液（0.0125、0.025、0.10、0.20μg/mL)抑菌圈 直径数据的校正值，单位为毫米（mm）.
7.2.4样品溶液的测定
每份样品溶液需三个检定用平板（7.2.2）.按7.2.3标准曲线制备的要求放置牛津杯，各平板中的三个牛津杯中注满参考浓度（0.05pg/mL）标准工作溶液，另三个牛津杯中则注满被测样品溶液.将陶确到0.1mm），分别求出被测样品溶液及参考浓度抑菌圈直径读数的平均值.
7.3确证试验
如被测样品溶液抑图菌直径读数的平均值≥10mm时，应做确证试验.
养30min.取三个检定用平板，按7.2.3标准曲线制备的要求放置牛津杯.各平板中的两个牛津杯中 取青霉素酶（4.3）并按产品说明稀释.将此稀释溶液按比例加到样品溶液中（1十19），（35土1)C培注满参考浓度（0.05μg/mL）标准工作溶液，另两个牛津杯中注满未加酶处理的样品溶液，最后两个牛津杯中则注满经酵处理的样品溶液.将陶瓦盖盖好，（35士1）C培养18h士1h后，如经酶处理过的样品溶液无抑菌圈形成，而未经酶处理的样品溶液仍有抑菌圈形成，说明样品溶液中的抑菌物质确为青霉素.
本方法的添加回收率数据参见附录B.
8结果计算
如被测样品溶液抑菌圈直径读数的平均值<10mm，即报告为"未检出”.如被测样品溶液抑菌圈乘以样品的稀释系数2，即得出以μg/mL计的青霉素含量，根据确证试验（7.3）报告结果. 直径读数的平均值≥10mm，按7.2.3要求校正后，从标准曲线上查出相应的青霉素含量（μg/mL），再 如果样品中青霉素的含量单位用mg/kg表示时，可将pg/mL按式（3）进行换算. *.( 3 ) 式中： X样品溶液中青霉素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
