中华人民共和国国家标准
GB/T19495.5-2018代替GB/T19495.5-2004
转基因产品检测 实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR） 检测方法
Detection of genetically modified organisms and derived products-Quantitative real-time polymerase chain reaction(PCR）methods
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
GB/T19495《转基因产品检测》分为如下儿部分：
GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求；GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法： GB/T19495.4转基因产品检测实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法；GB/T19495.5转基因产品检测实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测方法；GB/T19495.6转基因产品检测基因芯片检测方法：GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法： -GB/T19495.8转基因产品检测蛋白质检测方法：一GB/T19495.9转基因产品检测植物产品液相芯片检测方法.
本部分为GB/T19495的第5部分.
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
2004相比，除编辑性修改外主要技术变化如下： 本部分代替GB/T19495.52004（转基因产品检测核酸定量PCR检测方法），与GB/T19495.5-
一修改了标准的适用范围；一增加了分别基于基体标准物质以及质粒标准分子对样品中转基因植物品系进行定量检测的操增加了大豆、玉米、油菜、棉花、水稻、马铃薯、甜菜和木瓜等转基因植物品系拷贝数百分含量的 作规程；定量检测方法.
本部分由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局.
本部分主要起草人：黄新、李想、高宏伟、凌杏园、朱水芳、陈洪俊、潘良文、曹际娟、章桂明.
本部分所代替标准的历次版本发布情况为：
GB/T 19495 5-2004
转基因产品检测 实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR） 检测方法
1范围
产品中转基因品系含量的实时荧光PCR定量检测方法. GB/T19495的本部分规定了大豆、玉米、油菜、水稻（大米）、棉花、马铃薯、甜菜、木瓜等植物及其
本部分适用于上述植物及其产品中转基因品系拷贝数百分含量的定量检测方法.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T4562转基因检测实验室测量不确定度评估指南 JF1059.1测量不确定度评定与表示
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1.1
转基因transgene
将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过生物工程技术，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征的技术.
3.1.2
品系特异性event-specific
外源DNA插入受体作物基因组后经重组产生的邻接区序列.
3.1.3
实时荧光PCRreal-time polymerase chain reaction
在聚合酶链式反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，并通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.
3.1.4
内标准基因endogenousreference gene
在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因，该基因可用于判定物种特异性.
3.1.5
Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数.
3.1.6
定量下限limitofquantification;LOQ
在准确度和精确度处于可接受范围内时，样品中可稳定定量的分析物最低量或浓度.
标准物质reference material
具有一种或多种足够稳定、均一和确定的特性值，用以对设备进行校准、对测量方法进行评价或为材料定值的物质或材料.
3.1.8
基体标准物质matrixreferencematerial
来源于植物原材料（如植物种子、叶子、根茎等），通过对转基因品系及与其对应的非转基因品种材料通过一定质量比进行混合面制成的具有一定转基因成分百分比含量的标准物质.
3.1.9
质粒标准分子plasmidreference molecule
一种稳定存在的重组质粒分子，其包含了转基因检测的目标序列片段（如筛选基因片段、功能基因片段或品系特异性片段等），以及物种特异的内标准基因片段，可用于转基因产品定性定量检测.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.ACP1;酰基载体蛋白基因（acyl carrier protein 1)ADH1:乙醇脱氢酶 1 基因(alcohol dehydrogenase 1)BHQ1:黑洞灭基团 1(black hole quencher 1) bp：碱基对（base pair)CHY：木瓜凝乳蛋白酶基因（chymopapain gene）CruA：油菜种子储藏蛋白基因（cruciferin Agene） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid)dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate）dGTP：脱氧鸟书三磷酸（deoxyguanosine triphosphate)dNTP：脱氧核三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate) dUTP：脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate）EDTA:乙二胺四乙艘(ethylene diaminetetraacetic acid)FAM：羧基荧光素（6-carboxyfluorescein）GS：谷氨酸合酶基因（glutamine synthase gene)Lectin：植物凝集素基因 MGBNFQ：小沟结合物无荧光猝灭基团(minor groove binder nonfluorescent quencher)PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）PLD：磷脂酶 D 家族基因（phospholipase D family gene)SAH7：类拟兰芥属同源序列7的棉花内源基因（sinapis arabidopsis homolog 7gene） ROX：种荧光染料（carboxy-X-rhodmine)
Cf：采用质粒标准分子作为标准物质进行转基因成分定量检测的转换系数（conversionfactor）
SPS：蔗糖磷酸盐合成酶基因（sucrose phosphate synthase gene)Taq:DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane]UDG：尿嘧啶 DNA-糖基酶（uracil DNA glycosylase)UGPase:马铃薯UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（UDP-glucose pyrophosphorylase gene fromSolanum raberosun )
UNG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶（uracil-N-glycosylase)
4方法原理
的具有荧光标记的探针，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增 实时荧光PCR定量检测是在PCR反应体系中，除采用特异的引物外，还加人了与模板DNA匹配加.每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线.当荧光信号超过所设定的阀值（Threshold）时，荧光信号可被检测出来.
每个模板的C1值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小，利用已坐标代表Ct值-因此，只要获得未知样品的Ct值，即可通过制备的标准曲线计算出该样品的内标准 知起始拷贝数的基体标准物质或质粒标准分子可制备标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵基因和某品系的起始拷贝数，计算出的两个目标核酸拷贝数的比值（百分数）即为测定品系的相对百分含量.
5仪器设备和试剂
5.1仪器设备
5.1.2恒温孵育器或水浴锅.5.1.3实时荧光PCR仪.5.1.4离心机.5.1.6涡旋振荡器. 5.1.5高压灭菌锅.5.1.7生物安全柜.5.1.8核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.5.1.9微量移液器(2μL 10μL100μL 200pL、1 000 μL).
5.1.1样品粉碎仪或研磨机.
5.2主要试剂
除特别说明外，试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格.5.2.1实时荧光PCR预混液：为TaqDNA聚合酶（5U/μL）、PCR反应缓冲液、MgCl（3mmol/L~7mmol/L)、dNTPs（含dATP，dUTP，dCTP.dGTP) UNG酶等混合配制的溶液.5.2.2R0X：荧光校正试剂（50X，使用时稀释至1×）.5.2.3引物和探针：根据附录A表A.1的序列合成引物和探针，加双蒸水配制成100pmol/L储备液， 用于实时荧光PCR扩增的引物和探针浓度为10μmol/L
