中华人民共和国国家标准
GB/T 19495.9-2017
Detection of genetically modified organisms and derived productsLiquid bead array detection for plant products
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
GB/T19495《转基因产品检测》已经或计划发布以下部分：GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义；GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求；GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法； GB/T19495.4转基因产品检测核酸定性PCR检测方法；GB/T19495.5转基因产品检测核酸定量PCR检测方法；GB/T19495.6转基因产品检测基因芯片检测方法：GB/T19495.8转基因产品检测蛋白质检测方法： GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法：GB/T19495.9转基因产品检测植物产品液相芯片检测方法：GB/T19495.10转基因产品检测植物产品通用检测方法；GB/T19495.11转基因产品检测植物产品数字PCR检测方法；GB/T19495.12转基因产品检测首着实时荧光PCR检测方法，
本部分是GB/T19495的9部分.
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本部分由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口.
本部分由中国检验检疫科学研究院起草.
本部分主要起草人：王慧煜、付伟、杜智欣、韩雪清、魏霜、梅琳、朱鹏宇、刘佳佳、王晨光、邓婷婷、朱水芳、陈额.
转基因产品检测 植物产品液相芯片检测方法
1范围
GB19495的本部分规定了转基因成分的液相芯片定性检测方法.本部分适用于玉米、大豆、油菜、水稻、棉花等转基因植物及其产品CaMV35S和NOS基因的定性检测.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法
3缩略语
下列缩略语适用于本文件.PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）MF1：中位荧光强度值（Median Fluorescence Intensity）SA-PE：链霉亲和素-藻红蛋白（StreptavidinR-Phycoerythrin）
4原理
分子偶联.微球在制备过程中掺人了红色和橙色两种染料按照比例混合面成的荧光染料，两种染料分 液相芯片技术以荧光编码微球为基础，微球表面带有大量的活性基团，可与核酸探针、抗原、抗体等通过不同配比赋予了微球不同的颜色，从而把微球分为很多种，每种微球特异性的偶联针对目的DNA序列的寡核昔酸探针，就可以标记100种不同的探针分子，然后依次加人目的分子和带有荧光的报告分子，不同微球上的探针分子与不同的目的分子实现特异性结合，形成一个灵活性的液相芯片系统.该方法的信号识别与检测技术是流式细胞术，它可以将微球体快速排成单列通过检测通道，使用红色和绿 色两束激光对单个微球进行照射，红色激光通过分辨微球本身的光谱学指纹将微球分类对反应进行定性；绿色激光通过检测微球上结合的荧光报告分子量对反应进行定量.所得到的荧光信号经过光电倍增管后经电脑处理，最后对数据进行分析，得出结果.检测时，液相芯片检测仪只记录两种荧光同时出现时的荧光信号，不记录未结合的荧光报告分子信号.
本标准针对通用筛选元件CaMV35S启动子和NOS终止子设计选取特异性引物和探针进行液相芯片检测，并根据检测结果来判定CaMV35S启动子和NOS终止子的外源筛选元件成分.
GB/T 19495.9-2017
5试剂与材料
除非有特殊说明，仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水.
5.1DNA提取试剂盒
推荐针对不同的样品基质类型选取不同的基因组提取试剂盒.
5.218srRNA基因引物和探针
18sR;5'-生物素-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3' 18s-F:5'-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3'18s-P：5′-氨基-12个碳基-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3
5.3CaMV35S启动子基因引物和探针
CaMV35S-F;5'-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3' CaMV35S-R:5'-生物素-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3’CaMV35S-P：5′氨基-12个碳基-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-3’
5.4NOS终止子基因引物和探针
NOS-F:5'-CATGTAATGCATGACGTTATTTATG-3′NOS-R;5'-生物素-TTGTTTTCTATCGCGTATTAAATGT-3'NOS-P;5′-氨基-12个碳基-ATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAA-3
5.5荧光微球
羧基荧光微球，有5.6pm或者6.5μm两种规格，不同编号微球可偶联不同探针.
5.610×PCR缓冲液
用于PCR扩增反应，含有Tris-HCl(pH 8.3）、KCI和MgCl
含有 dATP dTTP dCTP 和 dGTP(各 2.5 mmol/L)
具有3'→5'核酸外切酶活性的耐热性DNA聚合酶（5IU/uL).
5.9TMAC杂交液
氯化四甲胺（tetramethylammoniumchloride）杂交液.
6仪器与设备
6.1Ⅱ级生物安全柜.6.3PCR仪，平均温度变化速度0.1C/s. 6.2涡旋震荡仪.2
6.4液相芯片检测仅，报告激光：532nm：分类激光：635nm，
7操作步骤
7.1抽样
按照GB/T 19495.1和GB/T 19495.7的规定执行.
7.2制样
按照GB/T 19495.1和GB/T 19495.7的规定执行.
7.3试样预处理
按照GB/T 19495.1和GB/T19495.3的规定执行.
7.4DNA模板制备
按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的规定执行.
7.5PCR反应
7.5.1PCR反应体系和反应条件
7.5.1.1PCR反应体系
PCR反应体系应在II级生物安全柜中操作.50μL反应体系中含10×PCRBuffer5pL，2.5 mmol/ L dNTP 4 μL 10 zmol/ L 的上 下 游 引I物 (包括 18s-F、18s-R、CaMV35S-F CaMV35S-R、NOS-F和NOS-R）各1 μL，DNA 模板1μL（100ng），ExTaq酶0.5pL，补双蒸水至终体积50μL.每个DNA样品做2个平行管（若平行误差超过10%，应重新检测）.加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液中，不要粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖，用涡旋震荡仅混匀.
7.5.1.2PCR反应条件
95C预变性5min：94℃变性30s，58C退火30s，72℃延伸30s35个循环；72C延伸10min
7.5.1.3对照设置
在液相芯片检测样品的同时，应设置阴性对照与空白对照，以与试样相同种类的非转基因植物基因组DNA作为阴性对照：以水作为空白对照.
7.5.2仪器设置
设定样品名称、探针编号和类型，微球数量等.
7.5.3杂交反应体系与杂交反应条件
7.5.3.1杂交反应体系
50L杂交反应体系中包括：1.5×TMAC杂交液33L，与18s-PCaMV35S-PNOS-P三种探针15 jL，PCR产物2μL，空白孔以2μLTris盐酸盐（pH=8）缓冲液取代PCR产物，阴性对照孔加2μL （探针浓度为100μmol/L）偶联的微球各0.5pL（每种微球约5000个），Tris盐酸盐（pH=8）缓冲液
