中华人民共和国国家标准
GB/T 19915.8-2005
Protocol ofreal-time PCR assay for virulence factors ofStreptococcus suis type2
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A为规范性附录.本标准由国家标准化管理委员会提出. 本标准由全国动物防疫标准化管理委员会归口.本标准由中国检验检疫科学研究院和江苏出入境检验检疫局负责起草.本标准主要起草人：林祥梅、吴绍强、韩雪清、贾广乐、刘建、梅琳、陈国强、张敬友、姜焱、唐泰山.本标准为首次发布.
猪链球菌2型毒力因子荧光PCR 检测方法
1范围
本标准规定了猪链球菌2型毒力因子MRP和EF检测的荧光PCR操作方法.本标准适用于检测生猪拭子、增菌培养物、疑似病料及猪组织样品中猪链球菌2型菌株的致病力.
2术语和定义
下列术语和定文适用于本标准.
2. 1
毒力因子virulence factor
（MRP）、胞外因子（EF）、溶血素、荚膜多糖以及44kDa蛋白、IgG结合蛋白、纤毛粘着素等.其中，溶菌 猪链球菌2型菌株的致病力与其毒力因子直接相关.猪链球菌2型的毒力因子有溶菌酶释放蛋白酶释放蛋白（MRP）和胞外因子（EF）是最主要的两个毒力因子，可作为判定菌株毒力的指标.一般认为表型MRPEF为强致病株，MRPEF-为弱致病株，MRP一EF-为非致病株，未发现MRP-EF表型.
3缩略语
本标准采用下列缩略语：
荧光PCR MRP 荧光聚合酶链反应 溶菌酶释放蛋白EF 胞外因子Cr值 荧光信号到达设定的阀值所经历的循环数FAM 6-基荧光素TAMRA 四甲基罗丹明
4实验材料与仪器
4.1实验试剂
实验试剂包括： 猪链球菌2型毒力因子荧光PCR检测引物、探针、阳性对照及常规PCR反应试剂：商品化的组织基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行.
4.2仪器
所用仪器包括：
一荧光PCR仪；高速冷冻离心机；台式离心机；旋涡混匀器；冰箱（2C~8C和-20C两种）； 微量可调移液器（0. 1 xL~2L、2pL~20μL 20μL~200μL、100 μL~1 000 yL 等规格）和相应配套的吸头.
5操作方法
5.1方法概要
荧光PCR方法是一种快速、灵敏、特异的检测病原体的方法.本研究选择猪链球菌2型的MRP和EF两个毒力因子基因设计引物进行PCR，同时在扩增序列中间设计了荧光探针，进行多重荧光PCR检测.反应结束即可根据扩增曲线判定有无目的基因，从面确定待检菌是否含有猪链球菌2型MRP和EF毒力因子基因，并据此判定其致病力.
5.2操作步骤
5.2.1实时荧光PCR扩增体系
取1uL培养菌液或从组织中提取的基因组DNA作为模板，加人按照表1配制的PCR反应液中.
表1荧光PCR反应液配制
试剂 体积/L10× PCR缓冲液（不含Mg) 25 mmol/L. MgCL; 2.5 3 02 5 mmol/L dNTP 2MRP引物及探针 1 5EF引物及探针 1 55 U/pL Taq DNA 聚合静 灭菌双蒸水 至总体积25 pl 0 5
进行待检样品扩增反应的同时，应设立标准阴、阳性菌株或DNA对照.操作时注意的问题见附录A.
5.2.2PCR扩增条件
将样品管放人荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：
-94C 预变性3min:-然后采用二步法进行反应：94C5s，50C10s.40个循环，每个循环结束后采集数据.
6结果判定
6.1判定方法
反应结束后，阔值的设定可根据仪器噪声人工调整，以阔值线刚好超过阴性样品扩增曲线的最高点为准.仪器将自动给出每个样品的C值.记录Cr值，分析检测结果.
6.2阳性判定
如果MRP的PCR扩增曲线Cr≤30，则表明为阳性，即待检菌株为猪链球菌2型致病株；对于弱致病株（目前未有MRP-EF毒型的报道），MRP-EF一为非致病株. MRP阳性菌株，以有无EF基因作为标准来判定其致病力.MRPEF十为强致病株，MRPEF一为
6.3明性判定
如果反应曲线（≥40，则为阴性.
6.4可疑判定
如果30<Ci<40，判为可疑，可以加大模板量再重复扩增，如果重复试验的Cr<40，则判为阳性，否则为阴性. 6.5无效扩增 如果阳性对照没有扩增曲线，或者阴性对照有Cr<30的扩增曲线，判定本次试验无效，需要分析试验失败原因，并重新试验. 附录A （规范性附录） 检测过程中生物安全和防止交叉污染的措施 A.1样品处理过程中必须戴一次性手套，并经常更换.PCR反应液配制过程中应在超净工作台等洁净环境中进行.A.2抽样和制样工具必须清洁干净，且用于试验的器Ⅲ和离心管、PCR管等必须经过121C、15min 高压灭菌后才可使用.A.3引物、探针等溶液应按照实际工作浓度一次性溶解好，并分装后使用，防止试验过程中污染.A.4试验前后，要把超净工作台的紫外灯打开，以破坏可能残留的DNA.A.5上机运行前应检查各PCR管盖是否盖紧，以防荧光物质泄露而污染机器.
