中华人民共和国国家标准
GB/T 20444-2006
猪组织中四环素族抗生素残留量 检测方法微生物学检测方法
Method for the determination of tetracycline antibiotics inswine tissue-Microbiological method
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准由中华人民共和国农业部提出并归口，本标准起草单位：农业部畜禽产品质量监督检验测试中心. 本标准主要起草人：李卫东、吴银良、李艳华.
猪组织中四环素族抗生素残留量 检测方法微生物学检测方法
1范围
本标准规定了猪组织中四环素族（四环素，金霉素、土霉素、强力霉素）残留量的检测方法.本标准适用于猪组织中四环素族（四环素、金霉素、土霉素、强力霉素）残留量的检测.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格及试验方法
3制样
3.1样品的制备
取适量新鲜或冷冻的空白或供试组织，搅碎并使均匀.
3.2样品的保存
样品在一20C冰箱中贮存备用.
4测定方法
4.1方法原理
加满四环素族（包括强力霉素、四环素、金霉素、土霉素）抗生素溶液，于培养箱中培养一定时间后，测量 四环素族抗生素具有很强的抑菌作用，在含有特定微生物的平板培养基上放人牛津杯，在牛津杯内抑菌圈直径的大小，根据抑菌圈的大小从标准曲线上求得样品中四环素族抗生素的含量.
4.2仪器和设备
4.2.1恒温培养箱：30C士1C.37C士1C，调整水平位置（隔层要求水平）.4.2.2高压灭菌锅. 4.2.3恒温水浴锅.4.2.4培养Ⅲl（塑料）：内径90mm土0.5mm，高26mm，m底平整光滑，厚薄均匀无凹凸现象.4.2.5陶瓦盖：内径110mm，外径116mm，高26mm.4. 2.6离心机;3 000 r/min~5 000 r/min 4.2.7均质器或组织捣碎机. 4.2.8牛津杯（即不锈钢小管）：内径6mm±0.1mm，外径7.8mm±0.1mm.高度10mm±0.1mm.4.2.9游标卡尺：测量抑菌周直径用，精密度0.05mm.4.2.10水平仪，4.2.11克氏瓶，4.3.1培养基 4.3试剂和材料4.3.1.1菌种培养基
胰蛋白陈 10 0 g牛肉膏 5.0 g琼脂 氯化钠 2.5 g 14 g~16 g蒸馏水 1 000 mL
将各种成分加热溶解于蒸馏水中，调pH至6.5，高压灭菌（121C，15min）.
4.3.1.2检定培养基
胰蛋白陈 牛肉膏 6. 0 g3 0 g 1. 5 g琼脂 14 g~16 g
酵母膏蒸馏水 1 000 mL将各种成分加热溶解于蒸馏水中，调pH至5.8.高压灭菌（121C，15min）.
4.3.2试剂
4.3.2.10.1mol/LKHPO 磷酸盐缓冲液（pH4.5）：精确称取13.6g磷酸二氢钾（分析纯）溶解于蒸馏水中，转移到1000mL容量瓶中并定容至刻度.115C高压灭菌30min，冷却后置4C冰箱中保存.4.3.2.2生理盐水：称取氯化钠8.5g溶解并用蒸馏水稀释至1000mL，115C高压灭菌30min.4.3.2.30.1mol/1.盐酸溶液.
4.3.3菌种 蜡样芽孢杆菌.
4.3.4标准品
四环素标准品、强力霉素标准品、金霉素标准品、土霉素标准品，密封避光，防潮保存在4C冰箱中.
4.3.5标准品贮备液和工作液
4.3.5.1备液
精确称取50mg四环素、强力霉素、金霉素、土霉素标准品（1000国际单位/mg），用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释定容至浓度为1000ug/mL，配制后置于冰箱中保存可使用一周.贮备液保存在4C冰箱中，可使用7天.
注：配制标准溶液用的各种器具，须干热灭菌或蒸汽消毒灭菌，无任何抗生素.
4.3.5.2工作液
取上述贮备液（包括四环素、强力霉素、土霉素）用磷酸盐缓冲液稀释配制成0.050μg/mL，0.100μg/mL.0.200pg/mL，0.400yg/mL，0.800μg/mL的稀释液，为制备标准曲线的标准浓度溶液0.100ug/mL的稀释液为参考浓度溶液.工作液要在使用当天配制.
金霉素稀释液：取上述原液用磷酸盐缓冲液稀释配制成0.005pg/mL，0.050μg/mL0.100μg/mL.0.200μg/mL，0.400μg/mL的稀释液，为制备标准曲线的标准浓度溶液0.100μg/mL 的稀释液为参考浓度溶液.
实验室用水应符合GB/T6682中三级水的规格，本方法中所用试剂，除特殊说明外，均为分析纯.
4.4测定步骤
4.4.1菌悬液的制备
1C培养7d，用25mL灭菌生理盐水冲洗菌答，恒湿水浴65C±1C加热30min，以2000r/min的速度 将鳍样芽孢杆菌接种于肉汤培养基中于37C士1C培养6h~8h后，接种于菌种培养基上30C士离心20min，除去上清液，保留下层，重复三次洗涤芽孢悬液，然后用50mL灭菌生理盐水制成芽孢悬液，放置4C冰箱保存备用，可故置2个月.
4.4.2芽孢悬液用量的测定
先试儿个平板，即把不同浓度的芽孢悬液加入检定用的培养基中使各标准品工作浓度中最小浓度的四环素族抗生素产生12mm以上的清晰、完整的抑菌圈面获得最适宜芽孢悬液用量.一般用量为每100mL检定用培养基内加0.5mL至1.0mL或芽孢计数后使1.0mL菌液含芽孢数约10个.
4.4.3检定用平板的制备
将适量芽孢悬液加到熔化后冷却至55C～60C的检定培养基中混匀，每个平Ⅲ内加人6mL，前后摇动平Ⅲ，使含有芽孢的检定培养基均匀覆盖于平Ⅲ表面，置水平位置，盖上陶瓷盖，待凝固后，每个平板的培养基表面放置6个小管，使小管在半径为2.8cm的圆面上成60°角的间距，所用平板须当天制备.
4.4.4样品制备
取样品约20g左右剪碎，称取其中10.0g加入0.1mol/1磷酸盐缓冲液10.0mL，小心搅匀，放置60 min，置灭菌的均质杯中（9000r/min~10 000r/min）均质2min（或置灭菌的乳钵内研磨成乳糜状），经4000r/min离心30min，其上清液作为被检样液.
4.4.5标准曲线的制备
取上述各标准品工作液和0.100μg/mL的标准溶液为参照浓度工作液按微生物琼脂扩散法测定各浓度的抑菌圈直径，其中最低标准品工作浓度作为阴性结果的平板对照，其他标准品工作浓度按式（1）和式（2）计算后用来绘制标准曲线：
式中：
L--标准曲线的最低浓度的抑菌圈直径（四环素、强力霉素、土霉素为0.050μg/mL，金霉素为0. 00 5μg/mL) ;D标准曲线的最高浓度的抑菌圈直径（四环素、强力霉素、土霉素为0.800μg/mL，金霉素为0 005 μg/mL) ;
c-参照浓度0.100μg/mL的抑菌圈直径的平均值；
a、b、d、e-标准曲线中其他标准浓度的抑菌圈直径经校准后的平均值.
然后根据计算所得的L和D作为横坐标，L和D对应的浓度的对数值作为纵坐标，绘制标准曲线.
4.4.6样品测定
另3个牛津杯中注满0.100μg/mL标准液.将培养Ⅲ小心轻放人30C士1C恒湿箱中，17h士1h培 每个样品取3个检定平板，每个检定平板放入6个牛津杯.将3个间隔的牛津杯中注满被检样液.养.培养后用游标卡尺测量抑菌圈内直径（精确到0.1mm），并分别求出平均值，经校正后，从标准曲线查出被检样液中四环素、强力霉素、金霉素、土霉素的含量，再乘以稀释倍数.
4.4.7空白试验
除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作.
4.5结果计算和表述
供试组织中四环素族抗生素残留含量按式（3）计算：
式中：
X一供试组织中四环素族抗生素含量，单位为毫克每千克（mg/kg）：（一供试试料试样溶液中四环素族抗生素浓度，单位为微克每毫升（pg/mL)：V供试试料试样溶液总体积，单位为毫升（mL)：
m供试试料质量，单位为克（g）.
