中华人民共和国国家标准
GB/T 20742-2006
牛甲状腺和牛肉中硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、 正丙基硫脲嘧啶、它巴唑、巯基苯并咪唑 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Method for the determination of 2-thiouracil methyl thiouracil propylthiouracil tapazole and 2-mercaptobenzimidazole residues in bovinethyroid and muscles-LC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局本标准主要起草人：庞国芳、张进杰、曹彦忠、郭彤彤、范春林、李学民、刘永明、曹亚平、刘小茂.本标准系首次发布的国家标准.
牛甲状腺和牛肉中硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、 正丙基硫脲嘧啶、它巴唑、巯基苯并咪唑 液相色谱-串联质谱法 残留量的测定
1范围
本标准规定了牛甲状腺和牛肉中硫腺喀啶（2-thiouracil）、甲基硫脲啶（methyl thiouracil）、正丙基硫脲喀啶（propyl thiouracil）、它巴唑（tapazole）硫基苯并咪唑（2-mercaptobenzimidazole）残留量液相色谱-串联质谱测定方法.
本标准适用于牛甲状腺和牛肉中硫脲嘧啶、甲基硫豚嘧啶、正丙基硫脲嘧啶、它巴唑、疏基苯并咪唑残留量的测定.
本标准方法的检出限：牛甲状腺和牛肉中硫脲喀啶、甲基硫脲嘧啶、正丙基硫脲嘧啶、它巴唑、硫基苯并味唑均为2pg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1:1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004 ISO5725-2：1994，IDT）
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992.neqISO3696：1987）
3原理
试样中残留的硫豚嘧啶、甲基硫豚嘧啶、正丙基硫脉嘧啶、它巴唑、蔬基苯并咪唑用乙酸乙酯提取，检测. 氨基固相萃取柱净化后浓缩，用4-氯-7-苯并映咱衍生化，再用固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯. 4.2乙晴：色谱纯.4.3乙酸乙酯：色谱纯.4.4磷酸氢二钠，NaHPO12HO4.5磷酸二氢钾，KH-PO，4.6乙酸. 4.7浓盐酸.4.8氢氧化钠.
4.9三氯甲烷，4.10正已烷.4. 114-氯-7-苯并映咱(4-chloro-7-nitrobenzo-2-furazan NBF-Cl)，C; H; CIN O :含量≥99 % 4.12蕴基乙醇：分析纯.4.13乙二胺四乙酸二钠，CHNONa2HO4.14无水硫酸钠：使用前650C灼烧4h.4.15磷酸盐缓冲溶液：pH=8，0.2mol/L.称取67.7g磷酸氢二钠（4.4）和1.5g磷酸二氢钾（4.5），4.16盐酸溶液：0.2mol/L.量取17mL浓盐酸（4.7)，用水定容至1000mL. 用水溶解，定容至1000mL.4.17氢氧化钠溶液：1mol/L.称取40g氢氧化钠（4.8），用水溶解，定容至1000ml.4.18衍生剂：5mg/mL.称取0.05g4-氯-7-苯并呋咱（NBF-C1）（4.11）溶于10mL甲醇（4.1），现用现配.4.19乙二胺四乙酸二钠溶液：0.1mol/L.称37.2g乙二胺四乙酸二钠（4.13）溶于1000mL水中. 4.20洗脱液：含3%乙酸的甲醇和三氯甲烷（1585）混合溶液.吸取3mL乙酸（4.6）于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀.吸取该溶液15mL于100mL容量瓶中，用三氯甲烷（4.9）定容至刻度，混匀.4.21定容液：含0.3%乙酸的乙晴水溶液.吸取0.3mL乙酸和15mL乙晴（4.2）于100mL容量瓶 中，用水定容至刻度，混匀.4.22标准物质：硫脲嘧啶（2-thiouracil，TU）、甲基硫脲喀啶（Methylthiouracil，MTU）、正丙基硫脲略啶（propylthiouracil PrTU）、它巴唑（Tapazole TAP)、疏基苯并咪唑（2-mercaptobenzimidazole MBI)，纯度≥99%.4.23内标标准物质：甲基蔬基苯并咪唑（2-methoxethox-mercaptobenzimidazole，MEMBI），纯度 ≥99%.4.24标准储备溶液：1.0mg/mL.称取适量的硫豚嘧啶、甲基硫豚嘧啶、正丙基硫脲嘧啶、它巴唑、殖基苯并咪唑标准物质（4.22），分别用甲醇配成1.0mg/mL的标准储备液.避光一18C保存，可使用6个月.4.25混合标准工作溶液：0.1μg/mL，吸取每种适量标准储备溶液（4.24），用甲醇稀释成0.1μg/mL 的混合标准工作溶液，避光一18C保存，可使用3个月.4.26内标标准储备溶液：1.0mg/ml.称取适量的甲基疏基苯并咪唑标准物质（4.23），用甲醇配成1.0mg/mL的标准储备液，避光一18C保存，可使用6个月.4.27内标标准工作溶液；0.1μg/ml.吸取内标标准储备溶液（4.26），用甲醇稀释成0.1pg/mL的 内标标准工作溶液，避光一18C保存，可使用3个月.4.28Sep-Park Amino Propyl固相萃取柱或相当者：500 mg，3 mL.使用前用20 mL正已烷预处理，保持柱体湿润.4.29Oasis HLB固相萃取柱或相当者：60 mg3mL.使用前分别用5mL甲醇和10 mL 水预处理，4.300.2m滤膜. 保持柱体湿润.
5仪器
5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g. 5.1液相色诺-申联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源.5.3液体混匀器.5.4固相萃取装置.2
5.5氮气吹干仪.5.6恒温振荡水浴.5.8微量注射器：25 gL，100 guL. 5.7真空泵：真空度应达到80kPa.5.9棕色具塞离心管：25mL，50mL.5.10pH计：测量精度士0.02pH单位，5.11液器：50mL.5.12离心机：转速大于4000r/min
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
6.1.1牛甲状腺样品的制备
发，备用. 取50g~100g阴性牛甲状腺组织，加人3倍质量的干冰，用组织接碎机绞碎后，使干冰在室温下蒸
6.1.2牛肌肉组织用组织捣碎机绞碎，分出0.5kg作为试样备用.
6.2试样保存
制备好的试样置于一18C冰柜中避光保存.
7测定步骤
7.1混合基质标准校准溶液的制备
7.1.1样品称取
分别加入不同量混合标准工作落液（4.25），使各被测组分的浓度均为1.0ng/mL、2.0ng/mL、 称取5个阴性样品，每个样品为1g（精确到0.01g），将上述样品置于50mL棕色离心管中（5.9），5.0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL.再分别加人适量内标标准工作溶液（4.27），使其浓度均为2.0ng/mL
7.1.2提取和初次净化
分别往上述离心管中加人10mL乙酸乙酯（4.3），3g无水硫酸钠（4.14），20gL硫基乙醇（4.12），30gL0.1mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（4.19），均质15s，再用5mL乙酸乙酯洗涤均质器刀头，二者合并，4000r/min离心5min，取上清液并在氮气吹干仪（5.5）上50C水浴吹干.用2mL乙晴溶解残余物，加入3mL正已烷（4.10）振荡1min，4000r/min离心5min，吸取并弃掉正已烷，再加3mL正己烷重复一次.剩余溶液在氮气吹干仪上50C水浴吹干.用0.5mL三氯甲烷溶解残余物，边摇边在超 声皱水浴中停留儿秒钟，加人3mL正已烷，涡旋混匀，倒人下接预处理好的Sep-ParkAminoPropyl固相萃取柱（4.28）的贮液器（5.11）中，在固相萃取装置（5.4）上使样液以小于2mL/min的流速通过SepParkAminoPropyl固相萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后用10mL正已烷淋洗固相萃取柱，弃去全部流出液.用5mL洗脱液（4.20）洗脱到25mL棕色离心管（5.9）中并在氮气欧干仅上50C水浴吹干.
7.1.3衍生化和再次净化
用5mL0.1mol/LpH=8的磷酸盐缓冲溶液（4.15）溶解上述残留物，加人0.3mL衍生剂（4.18)，涡旋混合1min，在50C恒温振荡水浴避光反应3h.衍生液放至室温，用o.2mol/L盐酸溶液（4.16）调节pH值在3~4之间，溶液倒入下接OasisHLB固相萃取柱（4.29）的贮液器中，在固相萃取洗固相萃取柱，弃去全部流出液.用真空泵（5.7）在65kPa负压下抽干Oasis HLB固相萃取柱10 min. 装置上使样液以小于2mL/min的流速通过OasisHLB柱，待样液全部通过固相萃取柱后用10mL水再用5mL乙酸乙酯洗脱被测物于25mL棕色离心管中，在氮气吹干仪上50C水浴吹干，残余物加
