中华人民共和国国家标准
GB/T 20747-2006
牛和猪肌肉中安乃近代谢物残留量 的测定液相色谱-紫外检测法和 液相色谱-串联质谱法
Method for the determination of metabolite residues of dipyrone inbovine and porcine muscle tissuesLC-UVandLC-MS-MSmethod
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A、附录B、附录C和附录D为资料性附录.本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局.本标准主要起草人：庞国芳、谢画琪、沈金灿、林燕奎、陈佩金、韩瑞阳.
本标准系首次发布的国家标准.
牛和猪肌肉中安乃近代谢物残留量 的测定液相色谱-紫外检测法和 液相色谱-串联质谱法
第一法液相色谱法
1范围
氨基安替比林（4-methylaminoantipyrine）和4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine）的液相色谱测定方法. 本部分规定了牛和猪肌肉中安乃近代谢物4-甲酰氨基安替比林（4-formylaminoantipyrine）、4-甲基
本部分适用于牛和猪肌肉中4-甲酰氨基安替比林、4-甲基氨基安替比林和4-氨基安替比林残留量的测定.
本部分的方法检出限：4-甲酰氨基安替比林为12.5pg/kg，4-氨基安替比林为15.0μg/kg，4-甲基氨基安替比林为20.0pg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分. 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1:1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004 ISO5725-2：1994，IDT）
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992 neqISO3696:1987)
肌肉中安乃近代谢物残留用硫酸钠溶液（pH=7)提取，过滤后经BondElutC固相萃取柱或相当者净化，用甲醇洗脱，氮气吹干，残渣用甲醇水溶解，供液相色谱仪测定，4-甲酰氨基安替比林用外 标法定量、4-甲基氨基安替比林和4-氨基安替比林用内标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.2乙晴：色谱纯 4.1甲醇：色谱纯.4.3硫酸钠.4.4亚硫酸钠.4.6硫酸钠亚硫酸钠提取溶液：准确称取14.20g无水硫酸钠和2.52g亚硫酸钠，用水溶解，并使 4.5乙酸铵：色谱纯其体积达到约950mL，然后用0.5mol/L的稀硫酸调节溶液的pH值至7.0.用水定容至1000mL.4.7淋洗液：甲醇水（595）.
GB/T 20747-2006
4.8样品定容液；甲醇水（19）.4.94-甲基氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林和4-氨基安替比林标准物质：纯度≥99%.4.10内标标准物质：4-异丙基氨基安替比林（4-isoproylaminoantipyrine），纯度≥99%. 4.11标准储备溶液：100mg/L.准确称取适量的各种安乃近代谢物标准物质（4.9），用甲醇（4.1）配制成浓度为100mg/L的标准储备溶液，避光一18℃保存，可使用3个月.4.12混合标准储备溶液：10.0mg/L.吸取每种适量标准储备溶液（4.11)，用甲醇稀释成10.0mg/L的混合标准工作溶液，避光一18℃保存，可使用1个月.4.13内标储备溶液：100mg/1.准确称取适量的内标标准物质（4.10）用甲醇（4.1）配制成浓度为 100mg/L内标储备溶液，避光一18℃保存，可使用1个月.4.14内标工作溶液：2.0mg/L.吸取适量的内标储备溶液（4.13），用甲醇稀释成2.0mg/mL的内标工作溶液，避光一18℃保存，可使用1个月4.15混合标准工作溶液：分别移取不同量混合标准储备溶液（4.12）于进样瓶中，再分别加入适量内标0.050μg/mL、0.10μg/mL、0.50μg/mL、1. 0μg/mL2.0μg/mL，内标物质浓度均为0.25μg/mL 工作溶液（4.14），用样品定容液（4.8）定容至1mL，使各被测组分的浓度均为0.010pg/mL、4.16BondElutC固相萃取柱或相当者：500mg3mL.用前分别用5mL甲醇和5mL水处理，保持柱体湿润.4.17滤膜：0.45 pm. 4.18玻聘滤纸.
5仪器
5.2固相萃取装置. 5.1液相色谱仪：配有紫外检测器.5.3氮气浓缩仪.5.4液体混匀器.5.5分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.6真空泵.5.8移液器：10yuL~100gL 和I 100μL~1 000μL. 5.7均质器.5.9聚丙烯离心管：50mL.具塞.5.10pH计：测量精度士0.02pH单位.5.11低温离心机：可制冷到4℃ 5.12玻璃离心管：15mL.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备6.2试样保存 取有代表性的牛或猪肌肉，制成实验室样品.试样分为两份，置于样品瓶中，密封，并做上标记.制备好的试样置于一18℃冰柜中避光保存.
7测定步骤
7.1提取
称取5g试样-精确至0.01g.将上述样品置于50mL聚丙烯离心管（5.9）中.加入0.25mL浓度为2.0mg/L的内标工作溶液（4.14），然后加人15mL硫酸钠亚硫酸钠提取溶液（4.6），均质1min，
在10C以4000r/min离心5min.将上清液转移到另一个干净的50mL容量瓶中，残渣再分别加人15mL、10mL硫酸钠亚硫酸钠提取溶液提取两次，离心后，合并上清液，并用硫酸钠亚硫酸钠提取溶液定容至50mL，混合均匀，然后用玻璃滤纸过滤，待净化.
7.2净化
取25mL提取液（7.1)放入C固相萃取柱（4.16）中，以约1mL/min的流速使样液通过固相萃取柱，待样液全部通过后，依次用5mL水和5mL甲醇水淋洗液（4.7）淋洗固相萃取柱，弃去全部流出液，减压抽干固相萃取柱10min.最后用5mL甲醇洗脱，洗脱液收集于15mL玻璃离心管中，置于氮 气浓缩仅（5.3）上在55C吹至近干，用样品定容液（4.8）定容至1.0mL.定容液混匀后，过0.45μm滤膜，供液相色谱测定.
7.3测定
7.3.1液相色谱条件
a）色谱柱：InertsilODS-3色谱柱，5μm，250mmX4.6mm或相当者； b）柱温：30℃；c）进样量：50gL；d）流动相、流速及梯度洗脱条件见表1；e）检测波长：265nm.
表1梯度洗脱条件
时间/min 流速/（ml/min） 水/(%） 甲醇/（%）0 1.0 90 1015 1 0 3017 1 0 5 9518 1. 0 90 1023 1. 0 90 10
7.3.2液相色谱测定
将混合标准工作溶液分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中4-甲酰氨基安替比林、4-甲基氨基安替比林和4-氨基安替比林的响应 值均应在仅器测定的线性范围内.在上述色谱条件下，4甲酰氨基安替比林的参考保留时间为10.61min，4-氨基安替比林的参考保留时间为13.60min，4-甲基氨基安替比林的参考保留时间为14.76min，内标化合物的参考保留时间为17.55min，安乃近代谢物标准物质的色谱图参见图A.1.
量.本方法的添加回收率数据参见附录C. 4-甲酰氨基安替比林采用外标法定量；4-甲基氨基安替比林和4-氨基安替比林采用内标法进行定
7.4平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定.
7.5回收率试验
溶液.阴性样品中添加标准溶液，按7.2操作，测定后计算样品添加的回收率. 吸取适量混合标准工作溶液和内标标准工作溶液，用样品定容液（4.8）稀释成所需浓度的标准工作
8结果计算
4-甲酰氨基安替比林结果按式（1）计算：
.(1)
