中华人民共和国国家标准
GB/T20760-2006
牛肌肉、肝、肾中的α-群勃龙、β-群勃龙残 留量的测定液相色谱-紫外检测法和 液相色谱-串联质谱法
Method for the determination of a-trenbolone.β-trenboloneresidues in bovine muscle liver and kidneyLC-UVmethod and LC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录，本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口.疫局.本标准主要起草人：庞国芳、郭春海、王风池、艾连峰.
本标准系首次发布的国家标准.
牛肌肉、肝、肾中的α-群勃龙、β-群勃龙残留量的测定 液相色谱-紫外检测法和液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛肌肉、肝、肾中a-群勃龙、3-群勃龙残留量的液相色谱-紫外检测法和液相色语-串联质谱测定方法.
本标准适用于牛肌肉、肝、肾中群勃龙、β-群勃龙残留量的测定.
限均为2μg/kg 本标准的方法检出限：α-群勃龙、B群勃龙的液相色谱-紫外检测法和液相色谱-串联质谱法的检出
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准. 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1;1994 IDT)
性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-1992，neqISO3696：1987)
柱净化，用配有紫外检测器的液相色谐仪或用液相色谱-串联质谱测定，外标法定量. 试样在pH=5.0条件下加酶水解，用乙酸乙酯提取群勃龙残留，经凝胶色谱净化仪（GPC）和硅胶
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯. 4.2乙酸：色谱纯.4.3乙晴：色谱纯.4.4乙酸乙酯.4.5环已烷. 4.6丙酮.4.7正已烷.4.8β-葡萄糖苷酸酶和芳基硫酸酯（βglucuronidase and aryl sulfatase）：100 000 unit/mL.4.9乙酸乙酯环已烷：50504.10丙酮正已烷：10十90.4.11丙酮正已烷：3070. 4.12乙酸钠缓冲液：0.02mol/L.pH=5.0.称取无水乙酸钠0.82g溶于500ml水中，用乙酸调节pH=5.0.
GB/T 20760-2006
4.13a-群勃龙、群勃龙标准物质：纯度≥98%4.14标准储备溶液：分别精确称取α群勃龙、β-群勃龙标准物质（4.13）各0.0100g，用乙晴（4.3）溶4.15混合标准工作溶液：取标准储备溶液（4.14）各5mL至50mL容量瓶中，用乙晴定容至刻度，配 解并定容至100mL，配制成100pg/mL的标准储备溶液.此溶液-18C冷冻保存，可使用六个月.制成混合标准工作溶液，浓度为10pg/mL，此溶液-18C冷冻保存，可使用三个月.4.16硅胶固相萃取柱：500mg，3mL；使用前用5mL丙酮正己烷（4.10）预处理，保持柱体湿润.4. 170.45m滤膜.
5仪器和设备
5.1液相色诺仪配有紫外检测器.5.2液相色诺-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）.5.3凝胶色谱仪.5.4均质器.5.5旋转蒸发仪.5.7离心机：最大转速5000r/min. 5.6旋涡混合器.5.8氮气浓缩仪5.9恒温水浴摇床.
6试样的制备与保存
牛肌肉、肝、肾组织用组织接碎机绞碎，分出0.5kg作为试样备用.
制备好的试样置于一18C冰柜中避光保存.
7测定步骤
7.1.1试样的称取
称取5个阴性样品，每个样品为5g（精确到0.01g），置于50mL具塞离心管中，再分别加人不同量混合标准工作溶液（4.15），使各被测组分的浓度均为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL.
7.1.2提取
萄糖苷酸酶和芳基硫酸酯（4.8），摇匀后盖好塞子置于恒温水浴摇床（5.9）上，37C振荡水解过夜（≥5h），待水解液冷却至室温后，加人20mL乙酸乙酯，在均质器（5.4）上以10000r/min的速度均质提取1min后，3000r/min离心（5.7）10min，将上清液过滤至鸡心瓶中.再用20mL乙酸乙酯重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中.
7.1.3净化
7.1.3.1凝胶色谱仪（GPC）条件
b）流动相：乙酸乙酯环己烷（5050），流速5.0mL/min；
c）定量环；5mL;d）净化程序：0min~10.5min弃去洗脱液，10.5min~15.5min收集洗脱液，15.5min~18min弃去洗脱液.
7.1.3.2GPC及硅胶固相萃取净化
将提取液在45C下蒸至近干，用乙酸乙酯环己烷（4.9）定容至10mL.的玻璃试管中，按7.1.3.1中GPC条件净化.净化后将收集的洗脱液蒸干，用3mL丙酮正己烷（4.10）旋涡振荡（5.6）溶解残渣，将溶液转移到预洗过的硅胶固相萃取柱（4.16）上的贮液器中，然后再用3mL丙酮正己烷（1090）溶解一次，将合并的溶解液过硅胶固相萃取柱，接着用3mL丙酮正己烷（1090）淋洗硅胶柱，最后用5mL丙酮正已烷（4.11）洗脱分析物并收集.洗脱液用氮气浓缩仅（5.8）在60C水浴中吹 干，用1mL流动相旋涡振荡溶解，过0.45um滤膜（4.17）供液相色语-紫外检测和液相色谱-串联质谱测定.
7.2试样溶液的制备
称取待测样品5g（精确到0.01g）于50mL带塞离心管中，按7.1.2和7.1.3操作.
7.3空白基质溶液的制备
称取阴性样品5g（精确到0.01g）于50mL带塞离心管中，按7.1.2和7.1.3操作.
7.4液相色谱法测定
7.4.1液相色谱条件
a）色谱柱：DiamonsilC，5μm，150mm×4.6mm（内径）或相当者；b）流动相：0.1%乙酸水溶液-乙晴-甲醇（502030）； c）流速：1.0mL/min;d）检测波长：345 nm;e）柱温：40C；{）进样量：50gL.
7.4.2色谱测定
度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪 在仪器最佳工作条件下，对基质混合标准校准溶液进样，以峰面积为纵坐标，基质混合校准溶液浓器测定的线性范围内.在上述色谱条件下，β-群勃龙、α群勃龙的保留时间分别约为11.2min和13.4min.标准物质的液相色谱图参见图A.1.本方法的添加回收率数据参见表B.1.
7.5液相色谱-串联质谱法测定
7.5.1液相色谱条件
a）色谱柱：InertsilCx，5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；b）流动相：0.1%乙酸水溶液乙晴（6238）；c)流速：0.3mL/min;d）色谱柱温度：35C；e）进样量：20L.
7.5.2质谱条件
a）离子源ESI，正模式；b）雾化喷嘴压力：0.24MPatc）干燥气流量；9.0L/min； d）干燥气温度：350C；e）毛细管电压、去集簇电压、碰撞电压等电压值应优化至最优灵敏度；f）检测离子对见表1.
