中华人民共和国国家标准
GB/T21035-2007
饲料安全性评价 喂养致畸试验
Feed safety evaluation-Feeding teratogenicity test
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准是在参阅了GB15193.14-2003致畸试验及国内外相关文献的基础上，根据我国技术发展水平研究制定的.
本标准由农业部畜牧业司提出.
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口.
本标准负责起草单位：中国农业大学动物医学院、中国兽医药品监察所.
本标准主要起草人：沈建忠、肖希龙、黄齐颐、张素霞、吴聪明.
饲料安全性评价 喂养致畸试验
1范围
本标准规定了喂养致畸试验的基本技术要求.本标准适用于饲料和饲料添加剂的致畸性评价.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB14922.1实验动物寄生虫学等级及监测GB14922.2实验动物微生物学等级及监测GB14924.1实验动物配合饲料通用质量标准GB14924.2实验动物配合饲料卫生标准GB14924.3实验动物小鼠大鼠配合饲料 GB14925实验动物环境及设施
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
3. 1 妊娠率gestation index妊娠鼠数占确认交配雌鼠数的百分比.
3.2分娩率parturition index分娩活仔雌鼠数占妊娠鼠数的百分比.
死胎率fetal mortality死胎仔数占分娩胎仔总数的百分比.
'E畸胎出现率incidence of terata 畸胎总数占活胎仔总数的百分比.
3.5畸胎总数sum of terata出现畸形的活胎仔数.
9' 单项畸形出现率incidence of single teratosis出现某种畸形的活胎仔数占活胎仔总数的百分比.
GB/T 21035-2007
3. 7活胎仔平均畸形出现率mean incidence of teratosis畸形总数占活胎仔总数的百分比.
3. 8畸形总数sumof teratosis
活胎仔出现的各种畸形种类数.
6' 母体畸胎出现率incidence of terata parturition分娩畸胎的母体数占妊娠母体总数的百分比.
4试剂及其配制
4.1乙醇固定液：95%乙醇. 除特别注明外，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合GB/T6682规定的二级用水要求.4.2鲍因（Bouins）固定液：取饱和苦味酸溶液750mL、40%甲醛250mL和乙酸50mL混合而成.4.3氢氧化钾溶液：分别配制1%和2%两种不同浓度的氢氧化钾溶液.4.4茜素红（alizarin red）贮备液：将茜素红加人5mL乙酸、10mL纯甘油和60mL1%水合氯醛的混 合液中至饱和.4.5茜素红应用液：取茜素红贮备液1mL，加1%氢氧化钾溶液至1000mL，用前临时配制.4.6脱水透明液A：甘油20mL、2%氢氧化钾溶液3mL，加蒸馏水至100mL.4.7脱水透明液B：甘油50mL、2%氢氧化钾溶液3ml，加蒸馏水至100ml
5仪器与设备
5.1实验室常用设备.5.2放大镜和解剖显微镜. 5.3游标卡尺（百分尺）.
6实验动物及饲养管理
常用实验动物为大鼠、小鼠.
首选大鼠，雌雄比例为1：1或2：1.大鼠交配时约12~14周龄，小鼠9~10周龄.使用清洁级大鼠和小鼠应符合GB14922.1和GB14922.2的要求.
实验动物词养环境应符合GB14925的规定，并注明动物饲养室的光照和通风条件，每天记录温度、湿度.笼养大鼠每笼不超过5只.饲料应符合GB14924.1、GB14924.2和GB14924.3的规定.
7剂量分组
至少设4组，即1个空白对照组（或溶剂对照组）和3个试验组.
试验组剂量一般选择在1/10~1/100母体LD之间.高剂量一般应使母体产生中毒症状：低剂量应不引起母鼠产生可观察到的中毒症状；在高剂量组与低剂量组之间设1个～2个中剂量组，设1个 空白对照组（或溶剂对照组），必要时，还要设阳性对照组.每组孕鼠不能低于12只.
8操作步骤
8.1受试物给予与观察
确证雌鼠受孕为止.雌鼠从交配前2周～4周开始给予受试物至孕期的第13天～第15天，在试验期 一般采用混饲或混饮给予受试物.原则上雄鼠交配前4周～8周开始给予受试物直至交配成功，间，每天观察试验鼠的体征、行为活动、采食和饮水情况，每周至少称1次体重，并同时计算采食量.
8.2受孕检查
雌、雄大鼠按1：1（或2：1）同笼后，每日早晨检查笼底有无阴道栓（石蜡状圆柱体）或用浸湿生理盐水的棉签取阴道分泌物涂布于滴有1滴生理盐水的玻片上，置低倍显微镜下检查有无精子.发现阴数不少于12只.
8.3孕鼠称重
孕鼠于孕期的0d、7d 14d和20d称重，以观察孕鼠的体重变化，随时注意记录孕鼠的状况.
8.4孕鼠处死和检查
大鼠在孕期第20天（小鼠第19天）将孕鼠处死.沿腹中线剖开腹腔，取出子宫.分别检查并记录左、右侧卵巢黄体数、窝重（子宫连胎鼠）、子宫重、着床数、活胎数、死胎数（含早期及晚期死胎）和吸收胎数.
8.5活胎鼠检查
出、眼部畸形（小眼、无眼、睁眼等）、鼻孔扩大、单鼻孔、唇裂、脊柱裂、四肢及尾畸形等等. 逐个记录活胎鼠体重、性别、体长，外观检查头颅外形、面部、躯干、四肢等有无畸形，包括露脑、脑膨
8.6胎鼠骨标本制作与检查
将每窝二分之一的活胎（奇数或偶数）放人乙醇固定液（4.1）中固定2周～3周.取出胎仔（可去皮、去内脏及脂肪）流水冲洗数分钟，放人至少5倍于胎仔体积的1%~2%氢氧化钾溶液（4.3）中作用8h~72h，然后将胎仔放入茜素红应用液（4.5）中染色6h~48h，并轻摇1次/d~2次/d，至头骨染红 为宜.再将胎仔放入透明液A（4.6）中1d~2d，放人透明液B（4.7）中2d~3d，待骨骼红染而软组织基本褪色为止.将胎仔标本放人小平皿内，用透射光源，在体视显微镜下作整体观察，逐步检查骨骼.
检查时先测量肉门的大小、矢状缝的宽度、头顶间骨及后头骨缺损情况，然后检查胸骨的数目、缺失或融合（胸骨为6个，骨化不完全时首先缺第5胸骨、次缺第2胸骨），检查肋骨（肋骨通常为12对～号（89- 13对，常见畸形有融合助、分又肋、波状肋、短肋、多肋、缺助、肋骨断裂），检查脊柱发育、椎体数目（颈椎检查四肢骨.
8.7胎鼠内脏检查
将每窝二分之一的胎鼠放人鲍因固定液（4.2）中，两周后作内脏检查.先用自来水冲去固定液，将形状和相对位置.切面制作见图1. 鼠仰放在石蜡板上，剪去四肢和尾，用刀片从头部到尾部逐段横切或纵切.观察不同切面器官的大小、
1--经口从上罚与舌之间向枕部横切（切面1)，可观察大脑、润脑、正脑、舌及飘裂； 2--从眼前缘垂直纵切（切面2），可观察鼻道、鼻中隔；3--从头部经眼球中央垂直纵切（切面31.可观察眼球、视网膜、晚球；4--从头部最大模位处纵切（切面41.可观察大脑及脑室：5-一沿下额水平穿过颈部模切（切面5）、可观察舌、咽、气管、食管和延髓.
图1胎鼠切面制作示意图
