中华人民共和国国家标准
GB/T21168-2007
Determination of tylosin residues in honey-LC-MS/MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国河南出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：吴斌、魏蔚、沈伟健、徐锦忠、陈惠兰、沈崇钰、赵增运、黄娟、蒋原、陶宏锦、
蜂蜜中泰乐菌素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了蜂蜜中泰乐菌素A残留量液相色谱-申联质谱测定方法提要、测定步骤和结果计算.本标准适用于蜂蜜中泰乐菌素A残留量的测定.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992 neqISO3696：1987)
3方法提要
试样用碱性溶液溶解后，泰乐菌素药物残留用固相萃取柱萃取，洗脱液浓缩后用甲醇溶液定容液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量.
4试剂和材料
4.1水：应符合GB/T6682规定的一级水.4.2甲醇：HPLC级.4.3碳酸钠：分析纯.4.5甲醇水（28）：量取20mL甲醇（4.2）与80mL水混合. 4.4碳酸氢钠：分析纯.4.6固相萃取柱：HLB或相当者，60mg.3mL.4.7泰乐菌素A标准：纯度≥95%.4.8泰乐菌素A标准储备溶液：1.0mg/mL.准确称取适量的泰乐菌素标准物质（4.7）.用甲醇配成4.9泰乐菌素A标准工作溶液：用空白样品提取液分别配成泰乐菌素浓度为2.0ng/mL、5.0ng/mL、 1.0mg/mL的标准储备液.储备液贮存在4C冰箱中，可使用两个月.10.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL、200 0ng/mL标准工作溶液.标准工作溶液在4C保存，可使用一周.4.10NaCO -NaHCO缓冲液（0.1mol/L)：称取5.3g碳酸钠和4.2g碳酸氢钠用适量水溶解后，稀释至1000 mL
5仪器
5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源.5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g各一台. 5.3氮吹仪.5.4旋涡混匀器.5.5贮液器：50mL.
GB/T 21168-2007
5.6真空泵：真空度应达到80kPa.5.7移液器：10mL.5.8离心管：50mL.具塞. 5.9刻度离心管：10mL.5.10滤膜过滤器：0.45μm，有机相.
6试样的制备与保存
6.1试样制备
对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀.对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60C的水浴中湿热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温.分出0.5kg作为试样.制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记.
6.2试样保存
注：在取样和制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化. 将试样于常温状态下保存.
7测定步骤
7.1提取
称取5g试样.精确到0.01g.置于50mL具塞离心管中，加人10mL 0.1 mol/LNaCO-NaHCO缓冲溶液，于液体混匀器上快速混合1min，使试样完全溶解.将混合液倒人下接（asisHLB柱（4.6）的贮液器中.使用前分别用3mL甲醇和5mL水预处理，保持柱体湿润.溶液以不高于2mL/min的流速通过OasisHLB固相萃取柱，待溶液完全流出后，用5mL水洗离心管和贮液管并过柱，然后再用5mL甲醇水（4.5）洗柱，弃去全部淋出液.在65kPa的负压下，减压抽干10min，最后用5mL甲醇 （4.2）洗脱，收集洗脱液于10mL刻度离心管（5.9）中，于50C用氮气吹干仪吹干，用甲醇（4.2）水（4.1）（3070）定容至1.0mL，过0.45μm的滤膜到进样瓶中.供液相色谱-质谱仪测定.
7.2测定
7.2.1液相色谱条件
a）色谱柱：Cs，5pm，150mm×2.1mm（内径）或相当者； b）流动相：水（A）甲醇（B）；c）流速：0.25 ml/min;d)梯度：0 min~5 0 min 20% ~90 %B 5 0 min~7 0 min 90 %B 7. 1 min~9. 0 min 20%B;e）柱温：30C；f）进样量：25jl
7.2.2串联质谱条件
a）离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子监测：b）扫描方式：选择离子检测（SRM）；c）雾化气、鞘气为高纯氮气，碰撞气为高纯氮气； d）电喷雾电压、碰撞电压等自动优化至最佳值；e）定性离子对、定量离子对和碰撞气能量见表1.
表1定性离子对、定量离子对和碰撞气能量
定性离子对（m/z) 定量离子对（m/z) 碰撞气能量/eV916 5/174 916 5/174 38916 5/772. 5 16
7.3液相色谱-串联质谱测定
泰乐菌素A标准工作溶液（4.9）在液相色谱-质谱设定条件下分别进样，以样品峰面积为纵坐标，工作溶液浓度（ng/mL）为横坐标，绘制6点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液 中泰乐菌素的响应值均应在仪器测定的线性范围内.在上述色谱条件下，泰乐菌素A参考保留时间为6.53min.泰乐菌素标准物质色谱、质谱图分别参见图A.1图A.2.
7.4空白试验
除不称取试样外，均按上述步骤进行.
8结果计算
结果用色谱数据处理机或按式（1）计算，计算结果需扣除空白值：
.( 1 )
式中：
X-试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；-从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；--样品溶液所代表试样的质量单位为克（g）. V样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）：
9检测低限和回收率
9.1检测低限
本方法对蜂蜜中泰乐菌素A残留量的检测低限为1.0pg/kg.
9.2回收率
蜂蜜中泰乐菌素A添加浓度及平均回收率的试验数据：在1.0μg/kg时，回收率范围为78.4%~107.8%；在5.0μg/kg时，回收率范围为70.1%~89.5%；在10.0μg/kg时，回收率范围为77.2%~101.1%； 在40.0μg/kg时，回收率范围为73.4%~94.8%.
