中华人民共和国国家标准
GB/T 22261-2008
Determination ofvirginiamycin in feedsHigh performance liquid chromatography
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口， 本标准起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心（南京）.本标准主要起草人：冯三令、耿士伟、储瑞武、冯群科、贾书静.
饲料中维吉尼亚霉素的测定 高效液相色谱法
1范围
本标准规定了饲料中维吉尼亚霉素含量的高效液相色谱测定方法.本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中维吉尼亚霉素含量的测定，检出限为0.5mg/kg，定量限为2mg/kg
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备
3原理
饲料中的维吉尼亚霉素用乙酸乙酯提取出来，提取液经硅胶柱和亲水亲脂平衡型固相萃取柱净化，在高效液相色谱仪（HPLC）反相柱上分离，用紫外检测器（或二极管阵列检测器）在210nm波长处检测，根据维吉尼亚霉素M和S峰面积加和值用外标法计算饲料中维吉尼亚霉素的含量.
4试剂和溶液
除特殊说明外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水符合GB/T6682中一级用水规定.
4.1乙酸乙酯4.2无水硫酸钠.4.3正已烷. 4.4无水乙酸乙酯-正已烷：将乙酸乙酯和正已烷按体积11混合，通过无水硫酸钠脱水.4.5乙睛.4.6甲醇.4.7乙酸铵缓冲溶液（pH4.0）：0.05mmol/L.称取3.85g无水乙酸铵，溶解于1000mL水中，用冰乙酸调节pH至4.04.8甲醇-乙酸铵缓冲溶液：将甲醇和乙酸铵缓冲溶液（4.7）按1：3比例混合，摇匀. 4.940%甲醇-水溶液：将甲醇和水按46比例混合，摇匀.4.10乙睛：色谱纯，用于配制流动相.4.11磷酸.4.12流动相：乙水磷酸=4006001，混匀，用前脱气. 4.13维吉尼亚霉素标准溶液4.13.1维吉尼亚霉素标准品：维吉尼亚霉素M和S总和不少于95.0%.4.13.2维吉尼亚霉素标准贮备液：准确称取维吉尼亚霉素标准品（4.13.1）100mg，置于100mL棕色
量瓶中，用乙晴（4.5）溶解定容，摇匀，该溶液中维吉尼亚霉素浓度为1mg/mL贮存于4C冰箱中，有效期三个月.中，有效期一周.
4.13.3维吉尼亚霉素标准系列工作液：准确吸取维吉尼亚霉素标准贮备液（4.13.2）置于棕色量瓶中， 用流动相（4.12）配制成浓度分别为2、5、10 25、50、100pg/mL的标准系列工作溶液.贮存于4C冰箱
5仪器和设备
5.2分析天平：感量0.1mg. 5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器.5.3涡旋混合器.5.4超声波水浴仪.5.5离心机：4 000r/min.5.6氮吹仪：可控温50C. 5.7固相萃取柱5.7.1硅胶柱：690mg/3 mL.5.7.2亲水亲脂平衡型固相萃取柱：60mg/3ml.5.9pH计. 5.8固相萃取装置.5.100.45μum微孔滤膜.
6试样制备
6.1按GB/T14699.1采样. 6.2选取有代表性饲料样品至少500g按GB/T20195制备样品.
7测定步骤
7.1提取
称取试样适量（配合饲料、浓缩饲料2g~5g，预混料1g~2g），精确至1mg，置于50mL离心管中，加2mL水，使试样充分湿润并混匀，加人20mL乙酸乙酯（4.1），加盖，置涡旋混合器上混匀后.置超声波水浴中超声提取30min.于离心机上以4000：/min离心10min.
准确吸取10mL上层乙酸乙酯清液于另一离心管中，加人5g无水硫酸钠（4.2）和10mL正己烷（4.3），置误旋混合器上充分混匀后，于离心机上以4000r/min离心10min，上清液备用.
7.2净化
用2.5mL无水乙酸乙酯-正已烷（4.4）预淋洗活化硅胶柱（5.7.1)，将上清液（7.1）小心转移入硅胶柱内（保持过柱流速不超过2mL/min，且不得抽干），用5mL无水乙酸乙酯-正已烷（4.4）洗涤离心管中无水硫酸钠，洗涤液一并转移人硅胶柱内，抽干，用2mL乙晴（4.5）淋洗硅胶柱，抽干.
（5.7.2），将抽干的硅胶柱安装在亲水亲脂平衡型固相萃取柱（5.7.2）的上面，用5mL甲醇-乙酸铵缓冲 用1mL甲醇（4.6）和1mL乙酸铵缓冲溶液（4.7）预淋洗活化亲水亲脂平衡型固相萃取柱溶液（4.8）淋洗硅胶柱，淋洗液正好通过亲水亲脂平衡型固相萃取柱（5.7.2）.保持过柱流速不超过2mL/min.淋洗完毕后，弃去硅胶柱，用5mL40%甲醇-水溶液（4.9）淋洗亲水亲脂平衡型固相萃取柱（5.7.2），弃去潜洗液.最后用5mL甲醇（4.6）进行洗脱，收集洗脱液，于50C氮吹仪上蒸发至干，用0.5mL~5mL的流动相（4.12）溶解残渣，过0.45gm微孔滤膜，供上机测定.
7.3色谱条件
7.3.1色谱柱：C柱，长150mm.内径4.6mm，粒径5pm，或相当者.
7.3.2柱温：室温.7.3.3流动相：同4.127.3.5检测器：紫外检测器（或二极管阵列检测器），检测波长210nm. 7.3. 4流速:1. 0 mL/min.
7.3.6进样体积：20L.
7.4定量测定
按上述色谱条件，分别将维吉尼亚霉素标准系列工作液（4.13.3）及试样溶液（7.2）上机测定，根据维吉尼亚霉素M和S峰面积加和值，用外标法定量.
7.5结果计算
试样中维吉尼亚霉素的含量（X）以质量分数（mg/kg）表示，按式（1）计算：
..(1)
式中：
X一试样中维吉尼亚霉素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；c试样溶液中M和S色谱峰面积加和值对应的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）：V加入试样中的乙酸乙酯总体积，单位为毫升（mL）；V最终溶解残渣用流动相的体积，单位为毫升（mL）； p维吉尼亚霉素标准品含量，%：m试样质量，单位为克（g）：V：-移取的乙酸乙酯体积，单位为毫升（mL）.结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字.
8精密度
在重复性试验条件下两次平行测定结果的相对偏差不大于10%.
