中华人民共和国国家标准
GB/T22287-2008
贝类中甲型肝炎病毒检测方法 普通RT一PCR方法和 实时荧光RT一PCR方法
Detection of hepatitis a virus in shelfish-ContentionalRT-PCRandreal-time fluorescenceRT-PCR
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为规范性附录.
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：陈广全、饶红、段洪安、冯骞、付博博、张惠媛、汪琦、曾静、张睿、李金华.
贝类中甲型肝炎病毒检测方法 普通RT一PCR方法和 实时荧光RT一PCR方法
1范围
本标准规定了贝类中甲型肝炎病毒的普通RT一PCR和荧光RT一PCR检测方法.本标准适用于贝类中甲型肝炎病毒核酸的检测.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，ISO3696：1987，MOD） GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193基因分析检测实验室技术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
3. 1
聚合酶链式反应polymerase chainreactionPCR
DNA模板先经高温变性为单链，在适宜的温度下和缓冲液中，两条引物分别与模板DNA两条链伸，如此反复变性、退火和延伸，使位于两段引物序列之间的DNA片段呈儿何倍数扩增. 上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP为底物，使退火引物得以延
3. 2
反转录-聚合酶链式反应reverse transeription polymerase chainreactionRT-PCR
RNA在逆转录酶的作用下，适宜反应条件下，被逆转录成cDNA.以cDNA作为模板进行PCR.
实时荧光RT-PCRreal-time fluorescence RT-PCR
实时荧光RT一PCR方法是在常规RT一PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针.该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团.探针完整时，报告基团发射的荧淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链就有一个荧光分 子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步.
3. 4
Ct值cyele threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数.
4缩略语
下列缩略语适用于本标准.
4.1HAV，甲型肝炎病毒.4.2TCID：：组织培养半数感染量，是病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度，一般使用ReedMuench 方法计算.
5试剂
除有特殊说明外，实验用试剂均为分析纯：实验用水均为去离子水，规格符合GB/T6682相关规定.
5.1甘氨酸缓冲液：见附录A中的A.1.1.
5.2PEG8000沉降液：见附录A中的A.1.2.
5.3裂解液：Trizol-reagent或其他等效产品.
5.4Poly（dt）磁珠：Dynalbeads-oligo（dt）25或其他等效产品.
注：给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示对该产品的认可.如果其能等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品.
5.51XRNA吸附缓冲液：见附录A中的A.2.5.
5.62×RNA吸附缓冲液：见附录A中的A.2.6
5.7洗涤缓冲液：见附录A中的A.2.7.
5.8QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen 529004）或其他等效产品.
5. 9Superscript one-step RTPCR with platinum Taq (Invitrogen Cat. No.10928-034) 或其他等效产品.
5. 10 Superscript first-strand syhthesis system for RT-PCR(Invitrogen Cat. No. 18080-051)或其他等效产品.
5.11Universal PCRMaster Mix（ABI ）或其他等效产品.
5.12普通RT-PCR检测引物序列（5'-3'）
正义引物（No.P1） CAGCACATCAGAAAGGTGAG反义引物（No.P2） CTCCAGAATCATCTCCAAC
5.13实时荧光RT-PCR检测的引物和探针
引物或探针序列（5'-3'）正义引物（HAV1) TTTCCGGAGCCCCTCTTG反义引物（HAV2） AAAGGGAAATTTAGCCTATAGCC反义引物（HAV3） 探针 FAMACTTGATACCTCACCGCCGTTTGCCT-TAMRA AAAGGGAAAATTTAGCCTATAGCC
加无RNase的去离子水配制成100pmol/L储备液.
5.14DNA分子量标记：100bp~2000 bp.
5.1550XTAE或其他等效缓冲液：见附录A中的A.1.3.
5.1610X上样缓冲液：见附录A中的A.1.6.
5.17甲肝减毒活疫苗：作为阳性对照添加于已知的阴性贝类样品中制成阳性质控样品.
5.18三氯甲烷：每次使用时注意防止Rnase污染.
5.19异丙醇：每次使用时注意防止Rnase污染.
1）给出这一信息是为了方便本标准使用者.并不表示对该产品的认可.如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品.
5.2075%乙醇：见附录A中的A.2.4.5.21无RNase的去离子水：见附录A中的A.2.35.23焦碳酸二乙酯. 5.22澳化乙锭（10μg/pL)：见附录A中的A.1.4.
6仪器与设备
6.1组织匀浆器（0r/min~20000r/min）.6.2PCR仅（PE9600或其他等效设备）. 6.3实时荧光PCR仪（AB17000或其他等效设备）.6.4凝胶成像系统.6.5恒温水浴（10C~95C）.6.6涡旋混勾器（200r/min~2500r/min）.6.7电泳仪（0V~300V）. 6.8酸度计（0~14.00pH，最小显示单位0.01pH，1mV）.6.9高速冷冻离心机（Meckman model J2-21或其他等效设备）.6. 10微量加样器(0. 1 pL~2 pL 1 μxl ~10 yL，20 μxL ~100pL100 yL~ 1 000 yμL 1 000 μL~6.11超低温冰箱（-80C）. 5 000 μL) 6.12带滤心的无Rnase 的微量加样器吸头（10pL，100pL 200pL.1mL).6.13无RNase 的离心管和PCR反应管（20 pL，1.5mL，2 mL）.6.14磁力搅拌器.6.15电子天平（最小精度值0.01g）.
7样品处理
7.1样品的运输与保存
样品至少应在4C以下的环境中进行运输.实验室接到样品后应尽快进行检测，如果暂时不能检测应将样品保存于一80C冰箱中.
7.2取样
用灭菌蒸馏水将贝壳表面的污泥清洗干净，打开贝壳后，倒掉腔内的液体，使用灭菌消毒的剪刀和银子取贝的消化道组织10g.
8病毒的富集
10g贝类消化道组织中加人70mL甘氨酸缓冲液（样品质量与缓冲液体积之比为1：7），组织匀浆器中充分碎混匀2min.取出匀浆液30mL，置37C孵育30min.于4C，15 000g，离心20 min.收集上清液，加人等体积三氯甲烷，涡旋混匀1min，室温放置5min，1700g，4C，离心30min.从上层液相取出15mL上清液，加人等体积的PEG8000溶液（PEG终浓度为8%），于4C过夜沉降病毒. 10000g.4C，离心5min.弃上清，保留沉淀.选择下列两种方法之一进行RNA提取.
9病毒RNA提取
9.1硅胶膜法
QIAamp Viral RNA MiniKit 或其他等效产品进行RNA提取.按照厂家的试剂盒使用说明进行 向沉淀中加人6mol/L的异硫氰酸胍溶液1mL尽量使沉淀充分溶解，涡旋混匀，使用Qiagen的操作.
