中华人民共和国国家标准
GB/T22595-2008
杀生剂能效的评价方法 异养菌
Test method for efficacy of antimicrobials-Aerobic bacteria
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准附录A、附录B为规范性附录.本标准由全国化学标准化技术委员会水处理剂分会（SAC/TC63/SC5）归口. 本标准由中国石油和化学工业协会提出，本标准负责起草单位：上海未来企业有限公司、中海油天津化工研究设计院.本标准主要起草人：刘昕、张全、邵宏谦、朱传俊.
杀生剂能效的评价方法异养菌
1范围
本标准规定了在冷却水系统中使用的杀生剂对异养菌杀灭能效的评价方法.本标准适用于氧化性及非氧化性杀生剂对异养菌的杀菌能效的评价.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备（GB/T603-2002，ISO6353-1：1982，NEQ)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987.MOD）
GB/T14643.1工业循环冷却水中黏液形成菌的测定平Ⅲ计数法
3方法提要
在含一定数量异养菌的试样中，定量的加人杀生剂，模拟杀生剂的使用条件（水质、pH值等），在选定的时间周期测定试样中存活异养菌的数量与试验起始时异养菌的数量做比较，计算此杀生剂对异养菌的杀生率.
4试剂和材料
本标准所用试剂和水，除非另有规定，应使用分析纯试剂和符合GB/T6682中三级水的规定，试验方法中所用制剂及制品，按GB/T603规定制备.
4.2蛋白陈：生化试剂. 4.1牛肉膏：生化试剂.4.3氯化钠.4.4琼脂：生化试剂4.5氢氧化钠溶液：40g/L. 4.6盐酸溶液：11.4.7乙醇溶液：75%（体积分数）.4.8牛皮纸.4.9镊子.4.10滤纸. 4.11医用脱脂棉.4.12医用脱脂纱布.
5仪器、设备
5.1无菌箱（室）或超净工作台. 5.2蒸汽压力灭菌器.5.3生化培养箱.
GB/T 22595-2008
5.4电热干燥箱：温度控制在60C~280C5.5刻度吸管：1mL.5.7容量瓶：1000ml. 5.6刻度吸管：5mL.5.9锥形瓶：500mL.5.11磨口锥形瓶：100mL. 5.10糖瓷量杯：1000ml.5.12微量进样器.
5.8培养Ⅲ：90mm.
6试验前准备
6.1培养基的制备
氯化钠5.0g-
琼脂：根据所用琼脂的凝固力及季节的不同适当增减，一般为15.0g~20.0g.
将上述试剂加水约950mL，在电炉上加热溶解后，趁热用四层医用脱脂纱布过滤于搪瓷量杯中，并用热水补充至1000mL.用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值至7.0±0.2，并分装在500mL锥形瓶中，每瓶装量不超过其总容量的2/3.塞上棉塞，用牛皮纸把瓶口包好，用蒸汽压力灭菌器于(121±1)C 灭菌15 min~30 min.
6.1.2液体培养基的制备：
称取下列试剂：牛肉膏3.0g.蛋白陈10.0g.
氯化钠5.0g-
将上述试剂加水约950mL，在电炉上加热溶解后，趁热用四层医用脱脂纱布过滤于搪瓷量杯中，并用热水补充至1000ml.用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值至7.0士0.2，并分装在500mL锥形瓶中，每瓶分装量不超过其总容量的2/3.塞上棉塞，用牛皮纸把瓶口包好，用蒸汽压力灭菌器于(121±1)C灭菌 15 min ~30 min
6.2试验用水的制备
6.2.1将水分装在100mL磨口锥形瓶中，塞上棉塞，每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭菌器于（121±1）C灭菌15min~30min.
6.3刻度吸管的灭菌
6.3.1将洗净并烘干后的刻度吸管粗编塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约10mm~15mm，棉 花不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉.
6.3.2每支刻度吸管用一条约40mm~50mm宽的牛皮纸条，以45左右角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，粗端用多余的纸条折叠打结，不使散开，标上量度，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于（160±2)C灭菌2h
6.4锥形瓶的灭菌
将锥形瓶的瓶口用棉塞塞紧，每个瓶子均用牛皮纸包扎以防污染，置电热干燥箱中，于（160土2）C灭菌2h.
6.5培养血的灭菌
将洗净并烘干后的培养皿10个左右叠在一起，用牛皮纸卷成一筒，置电热干燥箱中，于（160土2）C灭菌2 h.
6.6无菌箱（室）灭菌
把试验所用的无菌稀释水，无菌培养皿、无菌吸管等用品放入无菌箱（室）内，打开紫外线灯灭菌 30min.
6.7试样的制备
6.7.1试样可直接从开式循环水系统中采集，采集试样的循环水系统中异养菌总数在10cfu/mL～ 10”cfu/mL范围内时，可直接使用.6.7.2采集的循环水系统中异养菌总数低于10²cfu/mL时，应按附录A规定进行富集培养，将循环水系统中的异养菌含量提高至10cfu/mL~10cfu/mL范围内，得到试样.控制试样中的营养成分不能过高，以防止在杀生剂评价过程中对试验结果产生影响.
7评价方法
7.1试验杀生剂与浓度
7.1.1根据杀生剂的性能结合生产工艺条件（温度、pH值、污染物、水稳配方等）选取几种相对较为合适的杀生剂进行试验.对某些杀生剂的性能尚未了解时，可按附录B规定通过抑菌圈法或最低抑菌浓 度法试验了解其性能.
7.1.2作为高效杀生剂，在一般循环冷却水的正常处理中，杀生剂投加浓度选择范围应根据杀生剂的特性、使用条件等，在一定范围内选取几个浓度等级进行试验.
7.1.3为加药操作方便，试验前应将供试杀生剂原液用试验用水做稀释处理，稀释的程度以杀生剂稀超过1：100）.杀生剂稀释液应现用现配. 释液加人到试样中后，刚好达到试验所需要的浓度（稀释好的杀生剂的体积与要加入试样的体积比不得
7.2试验步骤
7.2.1一般性试验7.2.1.1本试验用于选择合适的杀生剂种类和恰当的投加浓度.（具体瓶数由同一批次试验的杀生剂总数和浓度等级数而定），并加棉塞.7.2.1.3按GB/T14643.1测定所取水样的异养菌存活菌数，即为同一批次试验的起始菌数.7.2.1.4将锥形瓶编号，每瓶对应地加人7.1.3中的杀生剂稀释液，充分摇匀.7.2.1.5将全部锥形瓶置于（29士1）C的恒温生化培养箱中培养. 7.2.1.6杀生剂加人后的第4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时（具体测定时间根据杀生剂的特性、使用条件等确定）测定锥形瓶中异养菌总数，即为不同时间异养菌存活菌数.
7.2.1.7杀生率以w计，数值以%表示，按式（1）计算：
式中：
p-起始菌数，单位以菌落数每毫升表示（cfu/mL）；p-存活菌数，单位以菌落数每毫升表示（cfu/mL).
7.2.1.8根据不同时间和浓度的杀菌率结果绘制某一浓度的时间-杀生率曲线和某一时间的浓度-杀 生率曲线.
7.2.2其他试验，可根据杀生剂的应用场所、应用条件、应用温度、pH值条件、药剂配方等条件的变化，在一般性试验的基础上做适当的条件改变，进行试验.
