中华人民共和国国家标准
GB/T22946-2008
蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素、交沙霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法
Determination oflinycin erythromycin，tilmicosin，tylosin，spiramycin.clindamycin，kitasamycin and josamycin residues in royal jelly andlyophilized royal jelly powder-LC-MS-MS method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局.本标准主要起草人：王飞、王海洋、曹彦忠、贾光群、张进杰、石玉秋、庞国芳.
蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、 红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、 克林霉素、吉他霉素、交沙霉素 残留量的测定液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素和交沙霉素残留量的液相色谱-申联质谱测定方法.
本标准适用于蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋毒素、克林毒素、吉他霉素和交沙霉素残留量的测定.
本标准的方法检出限：蜂王浆中的林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素、交沙霉素均为2.0pg/kg：蜂王浆冻干粉中的林可霉素、红霉素、泰乐菌素、克林霉素、交沙霉素均为2.0μg/kg，替米考星、螺旋霉素、吉他霉素均为5.0μg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
(GB/T 6379. 1-2004 1SO 5725-1;1994 IDT) GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，1SO5725-2：1994，IDT)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987，M0D）
3原理
蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素和交沙霉素的残留用Tris提取液提取，提取液经OasisHLB固相萃取柱净化，甲醇洗脱，洗脱液浓缩定容后，供液相色谱-中联质谱法测定.外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯.
4.1水：GB/T6682，-级.4.2甲醇：色谱纯. 4.3乙酸铵.4.4乙腊：色谱纯.4.5盐酸.
1）Oasis HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可.如果其他等效产品具有相同的效果.则可使用这些等效产品.
4.6三羟甲基氨基甲烷（Tris）；CHNO4.7氯化钙（CaCl2HO）.4.90.01mol/L乙酸铵溶液：0.77g乙酸铵（4.3）溶解于水中，定容于1000mL容量瓶中. 4.8甲醇溶液（23）：量取400mL甲醇（4.2）与600mL水混合.4.11Tris提取液：称取12.0g三羟甲基氨基甲烷（4.6）和7.35g氯化钙（4.7）溶解于水中，用盐酸（4.5）调节pH值为9，定容至1000rmL.4.12标准物质：林可霉素（CAS:7179-49-9）、红霉素（CAS:59319-72-1)、替米考星（CAS：108050-54-0)、泰 乐菌素（CAS：74610-55-2）、螺旋霉素（CAS：8025-81-8）、克林霉素（CAS：21462-39-5）、吉他霉素（CAS：1392-21-8）和交沙霉素（CAS：16846-24-5）纯度95%.4.13标准储备溶液I：1.0mg/ml.分别准确称取每种标准物质（4.12）适量，分别放人相对应的4.14标准储备溶液Ⅱl：10.Oμg/mL.分别吸取0.1mL各标准储备溶液（4.13）.分别放人相对应的 10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀.4C保存.10mL容量瓶中.用甲醇定容至刻度.4C保存.4.15标准工作溶液：2.0μg/mL.分别吸取2.0mL标准储备溶液（4.14）.分别放入相对应的10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度.4.16Oasis HLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL.使用前，依次用10mL甲醇和10mL水活化， 在抽真空前的各步骤中，都保持柱体湿润.4.17滤膜：0.2 μum.
5仪器
5.2天平：感量0.01g.0 0001g 5.1液相色谱-中联质谱仪：配有电喷雾离子源.5.3固相萃取装置.5.4氮气浓缩仪.5.5具塞聚丙烯离心管：50mL.5.6离心机. 5.7超声波清洗仪.5.8pH计.5.9振荡器.
6试样制备与保存
6.1试样的制备
从全部样品中取出有代表性样品约200g，充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内.密封后作为试样，标明标记.在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化.
6.2试样的保存
将蜂王浆试样于一18C保存.蜂王浆冻干粉试样密封保存，防止吸潮.
7测定步额
7.1提取
称取2g蜂王浆试样（蜂王浆冻干粉取1g）.精确至0.01g，置于50mL离心管（5.5）中，加入10.0mLTris 提取液（4.11），于振荡器上剧烈振荡10min.以18 000g 离心力离心 10min，取上清液以小于 1.0 mL/min 的流速通过Oasis HLB 固相萃取柱（4. 16).再加入 10.0 mL Tris 提取液（4.11)，2
于振荡器上剧烈振荡10min.以18 000g离心力离心10min 取上清液以小于1.0mL/min的流速通过 Oasis HLB 固相萃取柱.
7.2净化
待样液全部流出后，依次用10mL水和10mL甲醇溶液（4.8）洗柱，弃去全部流出液，将固相萃取柱用真空泵减压抽干1h.再用10mL甲醇（4.2）洗脱于15mL氮吹管中，用氮气浓缩仪于50C水浴中吹至近干，准确加人1.0mL定容液（4.10）后，于超声波清洗仪中溶解残渣.过0.2μm滤膜（4.17）后，供液相色谱-串联质谱仪测定.
7.3基质标准混合工作溶液的制备
7.3.1蜂王浆用基质标准混合工作溶液的制备：分别吸取1.0pL、2.0gL、5.0uL、25pl的林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素标准工作溶液（4.15），依次加人相对应的阴性样品中，按7.1、7.2步骤制备林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素分别为2.0ng/mL、5.0ng/ml、10.0ng/mL、50.0ng/mL四个浓度水平的系 列基质标准混合工作溶液.
7.3.2蜂王浆冻干粉用基质标准混合工作溶液的制备：分别吸取1.0uL、2.0pL、5.0μL25pL林可霉素、红霉素、克林霉素、泰乐菌素、交沙霉素标准工作溶液（4.15）和2.5L、5.0μL、10.0μL、25pL的替米考星、螺旋霉素、吉他霉素标准工作溶液（4.15），依次加人相对应的阴性样品中，按7.1、7.2步骤制50.0 ng/mL和替米考星、螺旋霉素、吉他霉素分别为 5.0 ng/mL、10.0ng/mL.20.0 ng/mL 50.0 ng/mL四 备林可霉素、红霉素、克林霉素、泰乐菌素、交沙霉素分别为2.0ng/mL、4.0ng/mL、10.0ng/mL、个浓度水平的系列基质标准混合工作溶液.
7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：AtlantisC，3μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；b）流动相：A：乙晴，B；0.1%甲酸水溶液，C：甲醇，梯度洗脱条件见表1；c）流速：0.2mL/min:d）柱温：30C：e）进样量：20pl.
表1梯度洗脱条件
时间/min A/% B/% C/%0 00 90 0 5 0 5 05 00 5 0 90 0 5 09 00 5 0 90 0 5 09 10 90 0 5 0 5 017 0 90 0 5 0 5 0
7.4.2质谱参考条件
a）离子源：电喷雾离子源： b）扫描方式：正离子扫描；c）检测方式：多反应监测；d）电喷雾电压：5500V；e）雾化气压力：0.24MPa；f）输助气流速：0.4L/min； g）离子源温度：550C：h）碰撞室出口电压：2.0V；
