中华人民共和国国家标准
GB/T22954-2008
河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素 和卡那霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination of streptomycin，dihydrostreptomycin andkanamycin residues in fugu and eelLC-MS-MS method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局.本标准主要起草人：刘晓茂、张守军、张进杰、曹彦忠、杨志伟、曹亚平、庞国芳.
河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素 和卡那霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量液相色谱-申联质谱测定方法.
本标准方法的检出限：链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的检出限均为10.0pg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1:1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994 IDT)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987.MOD）
3原理
柱净化.液相色谱-申联质谱仪（ESI十）检测，外标法定量. 河豚鱼或鳗鱼试样中的抗生素用磷酸溶液提取，三氯乙酸沉淀蛋白，用苯磺酸型和羧酸型固相萃取
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯.
4.1水：GB/T6682，一级. 4.2甲醇：色谱纯.4.3乙晴：色谱纯.4.4甲酸.4.5浓磷酸.4.6磷酸氢二钾（KHPO）. 4.7三氯乙酸（CHCIO）.4.8庚烷磺酸钠（CHNaO SHO）.4.95%磷酸溶液（119），取50mL浓磷酸（4.5），用水定容至1L，4.100.2mol/L磷酸盐缓冲溶液：pH=8.5.称取34.8g磷酸氢二钾（4.6）用水溶解，定容至1L.用4.11三氯乙酸溶液：50%，质量分数.取20g三氯乙酸（4.7），用水定容至20ml. 氢氧化钠溶液调节pH=8.5.4.120.01mol/L庚烷磺酸钠溶液：称取2.20g庚烷磺酸钠（4.8)，用水溶解，定容至1L.
4.13SPE洗脱溶液：取4mL甲酸（4.4），用0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液（4.12）定容至100mL.4.1425%甲醇溶液（13）取25mL甲醇（4.2）.用水定容至100ml.4.15标准物质：链霉素（CAS:3810-74-0)、双氢链霉素（CAS：128-46-1）和卡那霉素（CAS：25389-94-0）： 纯度均≥98%.4.161.0mg/mL标准储备溶液：称取适量的链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准物质（4.15），分别用0.3%乙酸水溶液溶解并配制成1.0mg/mL的标准储备溶液.避光保存于一18C冰柜中.4.170.1ug/mL混合标准溶液：吸取适量链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准储备溶液（4.16），用0.3%乙酸水稀释成0.1μg/mL的混合标准溶液，避光保存于-18C冰柜中. 4.18苯磺酸型固相萃取柱（500mg-3mL）或相当者.使用前依次用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润.4.19羧酸型固相萃取柱（500mg.3mL）或相当者.使用前依次用5mL甲醇和10mL水预处理保4.20滤膜：0.2 um. 持柱体湿润.
5仪器
5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源.5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g. 5.3液体混匀器.5.4固相萃取装置.5.5均质器.5.6真空泵：真空度应达到80kPa.5.7微量注射器；25L 100pl. 5.8pH计：测量精度士0.02pH单位.5.9具塞离心管：100mL.5.10刻度离心管：5ml.5.11贮液器：50mL.5.12离心机：转速4000r/min以上.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备实验室样品混合均匀，分出0.5kg作为试样.
6.2试样保存试样置于-18C冰柜，避光保存.
7测定步骤
7.1待测样品溶液的制备
7.1.1样品提取和初净化
称取河豚鱼或鳗鱼样品10g（精确到0.01g）.置于100mL离心管中，加人30mL5%磷酸溶液（4.9），均质3min，并用5%磷酸溶液清洗均质器刀头合并洗涤液，加人3mL三氯乙酸溶液（4.11）涡旋混合后在4000r/min下离心10min.上清液全部倒人下接苯磺酸型固相萃取柱（4.18）的贮液器中，5mL5%磷酸溶液（4.9）和10mL水洗涤苯磺酸型固相萃取柱（4.18），弃去全部流出液.用20mL磷 在固相萃取装置上使样液以小于2mL/min的流速通过萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后，依次用酸盐缓冲溶液（4.10）洗脱至50mL离心管中.
7.1.2样品溶液再净化
上述洗脱液倒入下接羧酸型固相萃取柱（4.19）的贮液器中，在固相萃取装置上使样液以小于2mL/min的流速通过萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后，依次用10mL水和10mL25%甲醇溶液 （4.14）洗涤羧酸型固相萃取柱（4.19），弃去全部流出液.减压抽干羧酸型固相萃取柱（4.19）30min.用2mLSPE洗脱液（4.13）洗脱至5mL刻度离心管中，用SPE洗脱液（4.13）定容至2.0mL，混匀后过0.2μm滤膜（4.20），供液相色谱-串联质谱测定.
7.2基质混合标准校准溶液的制备
称取五个阴性河豚鱼或鳗鱼样品10g（精确到0.01g），分别置于100mL具塞离心管中，加人适量混合标准溶液（4.17），制成链霉素、双氢链霉素和卡那霉素含量均为5.0μg/kg、10.0μg/kg、20.0μg/kg、100.0μg/kg和200.0gg/kg的基质标准溶液.其余按7.1步骤操作完成.
7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：Atlantis C3.5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；b）柱温：40C；c) 进样量：30guL:d) 流动相：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙睛溶液，流动相C为甲醇. 梯度洗脱参考条件见表1.
表1液相色谱梯度洗脱参考条件
时间/min 流速/(μL /min) 流动相A/% 流动相B/% 流动相C/%0 200 85 10 53 01 200 60 35 56 00 200 60 35 56 01 200 85 10 516 00 200 85 10
7.3.2 质谱参考条件
a) 离子源：电喷雾离子源（ESI）：b) 扫描方式：正离子扫描；c) 检测方式：多反应监测（MRM）；d) e) 电喷雾电压（IS)：5000V； 输助气（AUX）流速：7L/min；f) 输助气温度（TEM）：550C；g) 聚焦电压（FP）：150V；链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的质谱参数见表2.
表2链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的质谱参数
定性离子对 定量离子对 去额电压（DP）/ 采集时间/ 碰撞能量（CE）/化合物名称 (m/≥) (m/≥) V ms v链霉素 582/263 582/263 110 100 45(streptomycin} 582/246 55(dihydrostreptomycin) 双氢链霉素 584/263 584/246 584/263 100 100 55 43卡那霉素 485/163 485/163 34(kanamycin) 485/324 50 100 23
