中华人民共和国国家标准
GB/T22962-2008
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素、 氯地孕酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination of altrenogest，chlormadinone residuesin fugu.eel and baked eelLC-MS-MS method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.
本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口.
本标准负责起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：康海宁、谢丽琪、肖来龙、赵琼晖、张建莹、庞国芳.
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素、 氯地孕酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了河原鱼、嫂鱼和烤鳗中烯丙孕素（altrenogest）和氯地孕酮（chlormadinone）残留量的液相色谱-中联质谱测定方法.
本标准适用于河原鱼，鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素和氯地孕酮残留量的确证和定量测定.
本标准方法检出限：烯丙孕素和氯地孕酬的检出限均为0.5gg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 1-2004 ISO 5725-1:1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，1SO5725-2：1994，IDT）
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987，MOD）
3原理
试样在37C经过16h酶解后，采用乙提取试样中残留的烯丙孕素和氯地孕酮，提取液经乙睛跑和正已烷脱脂、固相萃取柱净化，电喷雾离子化，液相色谱-中联质谱检测和确证，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯. 4.2乙晴：色谱纯.4.3正已烷：色谱纯.4.4甲酸：色谱纯.4.5乙酸铵：色谱纯.4.7乙酸钠. 4.6氯化钠.4.8乙酸.4.93-葡萄糖苷酸/硫酸酯酶：116300unit/mL.4.10乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L pH5.2.称取16.4g乙酸钠（4.7）溶解于800mL水中.用乙酸（4.8）调节pH值至5.2.用水定容至1000mL. 4.11乙晴饱和正已烷：取500mL正已烷（4.3），加入适量乙晴（4.2），充分振摇后，待两相分层，上层即为乙晴饱和正已烷溶液.
4.1220%乙睛水溶液：量取20mL乙脂（4.2）和80mL水，混合均匀.4.13样品定容溶液：量取50mL乙晴（4.2）和50mL水，混合均匀，加人0.1mL甲酸（4.4），混合4.140.005mol/L乙酸铵（含0.05%甲酸）：准确称取0.3854g乙酸铵（4.5），用水溶解并转移至 均匀.1000mL容量瓶中.加人0.5mL甲酸（4.4）.用水定容至刻度线.4.15标准物质：烯丙孕素（CAS：850-50-2）、氧地孕酮（CAS：302-22-7），纯度均大于99%.4.16标准储备溶液：分别称取适量的烯丙孕素和氯地孕酮标准物质（4.15），用甲醇（4.1）配制成浓度4.17混合中间标准溶液1：吸取适量的各标准储备溶液（4.16)，用甲醇（4.1）稀释成浓度为1.0mg/L 为100mg/L的标准储备溶液，一18C以下避光保存.的混合中间标准溶液I，0C~4C避光保存.4.18混合中间标准溶液Ⅱ：吸取适量的各标准储备溶液（4.16），用甲醇（4.1）稀释，配制成烯丙孕素浓度为1.5mg/L，氯地孕酮浓度为1.0mg/L的混合中间标准溶液Ⅱ，0C~4C避光保存.4.20膜;0.2 μm.
5仪器和设备
5.1液相色谱-中联质谱仪：配有电喷雾离子源（ES1）.5.2均质器. 5.3旋涡混匀器.5.4恒温空气浴掘床.5.5固相萃取装置.5.6吹氮浓缩仪.5.7分析天平：感量0.1mg和0.01g. 5.8移液器：10 yL~100 yL和 100μL~1 000pL.5.9聚丙烯离心管：15mL和50mL.具塞.5.10容量瓶：100mL和1000mL.5.11离心机：转速不低于5000r/min.
6试样制备与保存
6.1试样制备
河豚鱼、鳗鱼取连皮的鱼肉，将皮、肉分离后取鱼皮置于微波炉中，加热后连同鱼肉、鳗鱼制品取可食部分一并放入组织捣碎机均质，充分混匀，装人清洁容器内，并标明标记.制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化.
6.2试样保存
试样于一18C以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在2C~6C贮存72h.
7测定步骤
7.1样品提取
30gL葡萄糖苷酸/硫酸酯酶（4.9），旋涡振荡2min，置于37C恒温空气浴摇床中酶解16h.酵解后的 称取待测样品5.0g（精确至0.01g）于50mL具塞离心管中，加人10mL乙酸钠缓冲溶液（4.10），样品溶液冷却至室温后，加人10mL乙（4.2），旋涡混匀1min，在往复式振荡器上振荡提取5min，3000r/min离心5min，将上清液转移至另一50mL离心管中.在残渣中加人10mL乙晴，重复提取2
一次，5000r/min离心5min，合并乙睛层.在乙提取液中加人5g氯化钠（4.6），旋涡混匀1min，5 000r/min离心3min.取上层乙睛层8mL于15mL离心管中，加入4mL乙晴饱和正已烷溶液（4.11），充分振摇，5000r/min离心3min，弃去上层有机溶液.再加人4mL乙晴饱和正已烷溶液，重10 mL.待净化. 复上述操作一次.将经脱脂处理后的乙睛提取液置于45C水浴下吹氮浓缩至2mL，加水定容至
7.2净化
将7.1中所得溶液转入活化好的HLB固相萃取柱（4.19）中，以约3mL/min的流速使样液全部通过固相萃取柱，弃去流出液.再分别用3mL20%乙晴水溶液（4.12）、3mL水淋洗，弃去流出液，用真干，用样品定容溶液（4.13）溶解并定容至1.0mL，旋误混匀后过0.2gm滤膜（4.20），用液相色谱-中联 空泵抽干固相萃取柱15min.用3mL乙晴洗脱被测物于15mL离心管中，45C水浴下吹氮浓缩至近质谱仪测定.
7.3基质空白液和基质混合标准工作液的制备
称取阴性样品5.0g（精确至0.01g）于50mL具塞离心管中，按7.1和7.2操作制备基质空白液：混合标准工作液根据需要于使用前用基质空白液配制.
7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：C色谱柱，1.7pm.50mm×2.1mm（内径）或相当者；b）柱温：40C；c）进样量：10gL;d）流动相、流速及梯度洗脱条件见表1.
表1流动相、流速及梯度洗脱条件
时间/rsin 流速/(mL/min) 0.005mol/1.乙酸铵溶液（含0 05%甲酸1/% 甲醇/%0 0 0 30 50 505 0 0 30 20 806 0 0 30 5 956 1 0 30 50 507 5 0 30 50
7.4.2质谱参考条件
b）扫描方式：正离子扫播； a）离子化模式：电喷雾离子源；c）检测方式：多反应监测（MRM）：d）分辨率：单位分辨率；e）电喷雾电压：3000V；f）输助气流速：700L/h；h）幕帘气流速：50 1/h； g）碰撞气：氧气；i）离子源温度：105C；j）辅助气温度：400C；k）定性离子对、定量离子对、采集时间、锥孔电压及碰撞能量见表2.
