中华人民共和国国家标准
GB/T22971-2008
Determination of metabolite residues of dipyronein milk and milk powder-LC-MS-MS method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准附录A、附录B为资料性附录.
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.
本标准负责起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：沈金灿、谢丽琪、肖陈贵、朱玉兰、熊贝贝、林燕奎、庞国芳.
牛奶和奶粉中安乃近代谢物 残留量的测定液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛奶和奶粉中安乃近代谢物4-甲酰氨基安替比林（4-formylaminoantipyrine）、4-乙酰氨基安替比林（4-acetylaminoantipyrine）、4-甲基氨基安替比林（4-methylaminoantipyrine）和4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine）的液相色谱-串联质谱测定方法.
本标准适用于牛奶和奶粉中4-甲酰氨基安替比林、4-乙酰氨基安替比林、4-甲基氨基安替比林和4-氨基安替比林残留量的测定.
本标准的方法检出限为：对于牛奶，4-甲酰氨基安替比林、4-氨基安替比林、4-甲基氨基安替比林和4-乙酰氨基安替比林均为5.0μg/kg；对于奶粉，4-甲酰氨基安替比林、4-氨基安替比林、4-甲基氨基安替比林和4-乙酰氨基安替比林均为40.0μg/kg.
2规范性引用文件
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 1-2004 ISO 5725-1:1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004 1SO5725-2：1994 IDT)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008 1SO3696：1987，MOD)
3原理
牛奶和奶粉中安乃近代谢物残留加人Tris溶液后用乙提取，提取液经正已烷脱脂净化，液相色谱-串联质谱仪测定.4乙酰氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林和4-氨基安替比林采用外标法定量，4-甲基氨基安替比林采用内标法进行定量.
4试荆和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2异丙醇.4.3乙睛：色谱纯.4.4三羟甲基氨基甲烷（Tris）. 4.5乙酸铵：色谱纯.4.61.0mol/LTris溶液：准确称取12.1g三羟甲基氨基甲烷，用水定容至100mL.4.7样品定容溶液：甲醇-水（119）.
4.85mmol/L乙酸铵溶液：准确称取0.385g乙酸铵，用950mL水溶解，用乙酸将溶液调至pH3.0，再加水定容至1000mL.4.94-甲基氨基安替比林（4-methylaminoantipyrineC：HN O，CAS：519-98-2）、4-乙酰氨基安替比pyrine-CHN OCAS：1672-58-8)和 4-氨基安替比林(4-aninoantipyrineC H NO CAS:83-07-8)标 林（4-acetylaminoantipyrine ， C H: N O; ， CAS：83-15-8）、4-甲酰氨基安替 比林（4-formylaminoanti-准物质：纯度≥99%4.10内标标准物质：4-异丙基氨基安替比林（4-isopropylantipyrineCHNO），纯度≥99%4.11100mg/L标准储备溶液：准确称取适量的各种安乃近代谢物标准物质（4.9）.用甲醇（4.1）配制成浓度为100mg/L的标准储备溶液，避光一18C保存.4.121.0mg/L混合标准储备溶液：吸取每种适量标准储备溶液（4.11）.用甲醇稀释成1.0mg/L的 混合标准工作溶液，避光一18C保存，4.13100mg/L内标储备溶液：准确称取适量的内标标准物质（4.10）用甲醇（4.1）配制成浓度为100mg/L标准储备溶液，避光-18C保存.4.141.0mg/L内标工作溶液：吸取适量的内标储备溶液（4.13），用甲醇稀释成1.0mg/mL的内标标准工作溶液，避光一18C保存.4.15基质混合标准工作溶液：吸取适量的混合标准储备溶液（4.12）和适量内标工作溶液（4.14），用空 白样品提取液配成浓度为1.0pg/L、5.0pg/L、10.0μg/L、20.0pg/L、40.0μg/L、100μg/L和内标浓度为10.0pg/L的基质混合标准工作溶液.当天配制.4.16滤膜：0.2 ym
5仪器和设备
5.1液相色谱-中联质谱仪：配有电喷雾离子源（ES1）.5.2旋转蒸发仪.5.3旋涡混匀器.5.4分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.5移液器：10L~100L和100L~1 000μl5.6带刻度聚丙烯离心管：15mL和50mL，具塞. 5.7低温离心机：转速大于5000r/min，可制冷到4C.5.8容量瓶：25mL.5.9鸡心瓶.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备取不少于500g有代表性的牛奶或奶粉，充分混匀，分为两份，置于样品瓶中，密封，并作上标记.6.2试样保存牛奶置于4C冰柜中避光保存，奶粉则在室温下置于干燥器保存，
7测定步骤
7.1提取
称取5g试样.精确至0.01g，置于50mL带刻度的聚丙烯离心管（5.6）中，加人100pL内标工作2
溶液（4. 14）和0.5mL 1. 0mol/L的Tris 溶液（4.6），再加入 10mL乙睛.旋涡混合1 min，振荡提取上述操作.合并提取液，用乙晴定容至25mL，混匀.
7.1.2奶粉
取12.5g奶粉，精确至0.01g.置于100mL烧杯中.加适量35C~50C水将其溶解，待冷却至室按7.1.1步骤进行处理.
7.2净化
取5.0mL提取液至干净的15mL离心管中，加人3.0mL乙睛饱和过的正已烷，旋涡振荡3min，4C下5000r/min离心5min，弃去正已烷层.
将乙晴层转移至鸡心瓶（5.9）中，再加入5.0mL异丙醇，在40C下旋转蒸发至近干.残渣加人1.0mL样品定容溶液（4.7）溶解，混勾后过滤膜（4.16），供液相色谱-中联质谱测定.
7.3空白基质溶液的制备
称取阴性样品5g（精确至0.01g）.按7.1和7.2步骤操作.
7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：C色谱柱，1.7pm，50mm×2.1mm（内径）或相当者；b）柱温：40C； c）进样量：10l；d）流动相、流速及梯度洗脱条件见表1.
表1流动相、流速及梯度洗脱条件
时间/min (uu/u)/聚累 5 mmol/1. 乙酸铵落液(pH 3 0)/% 甲醇/%0 0.25 95 53 0 0 25 85 154 0 0 25 10 904.1 0.25 95 55 5 0 25 95 5
7.4.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a）离子源：电喷雾离子源；b）扫描方式：正离子扫描；c）检测方式：多反应监测（MRM）；d）电喷雾电压：3000V；e）撞气：氢气：g）辅助气温度：350C； 输助气流速：750L/h；h）离子源温度：105C；i）参考保留时间、定性离子对、定量离子对、碰撞能量及锥孔电压见表2.
