中华人民共和国国家标准
GB/T22974-2008
Determination of isometamidium residues in milk and milk powderLC-MS-MS method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.
本标准主要起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司.
牛奶和奶粉中氮氨菲啶残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛奶和奶粉中氮氨菲啶残留量的液相色谱-串联质谱测定方法.本标准适用于牛奶和奶粉中氮氨菲啶残留量的测定.本标准方法检出限：牛奶为0.010mg/kg，奶粉为0.080mg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1-2004 ISO 5725-1 ;1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987，MOD)
3方法原理
试样中的氮氨菲啶用乙晴和甲酸铵甲醇混合溶液提取，提取液经浓缩、脱脂后，用液相色谱-中联质谱仪测定，外标法定量，选择离子定性.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.3乙腊：色谱纯. 4.2甲酸：色谱纯.4.4正已烷：色谱纯.4.5甲酸铵.4.60.25mol/L甲酸铵甲醇溶液：称取15.76g甲酸铵（4.5）溶于1000mL甲醇（4.1)中.4.780%甲醇水溶液：量取80mL甲醇（4.1）加人20mL水中.4.8饱和了80%甲醇水的正已烷溶液：在分液漏斗中加人300mL正已烷（4.4），取适量80%甲醇水 溶液（4.7）进行振荡、静置分层，弃去下层甲醇水溶液，上层正已烷溶液备用.4.9提取液：量取乙晴（4.3）和0.25mol/L.甲酸铵甲醇溶液（4.6）按照1：1（体积比）进行混合.4.10氮氨菲啶盐酸盐标准品：纯度大于或等于97%.4.11氮氨菲啶标准储备溶液：准确称取适量氮氨菲啶盐酸盐标准品，用甲醇（4.1)配成浓度为 100pg/mL的标准储备溶液.此溶液在OC～4C冰箱中避光保存.4.12氮氨菲啶标准中间液：准确吸取5mL的氮氨非啶标准储备溶液（4.11）于50mL棕色容量瓶中，用甲醇（4.1）定容至刻度，配制成浓度为10μg/mL的氮氨菲啶标准中间液.该溶液于0C~4C冰箱
中避光保存.4.13氨氨菲啶基质标准工作溶液：根据需要吸取适量的氨氨基啶标准中间液（4.12），用阴性样品提取4. 14滤膜：0. 2 ym. 液稀释配制成浓度范围为2.5ng/mL~200ng/mL的系列基质标准工作溶液，该溶液应现用现配.
5仪器和设备
5.1液相色谱-中级质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）.5.2分析天平：感量0.01mg和0.01g. 5.3振荡器.5.4超声波清洗器.5.5旋转蒸发器.5.6旋涡混合器.5.7离心机：转速不小于10000r/min.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
6.1.1牛奶：取有代表性试样约500g搅拌均匀后装人洁净容器内密封并做好标识. 6.1.2奶粉：取有代表性试样约500g，搅拌均匀后装入洁净容器内密封并做好标识.准确称取12g乳粉试样（精确到0.01g）于250mL烧杯中，少量多次加人50mL煮沸并冷却到60C左右的水溶解，冷却至室温后，移人100mL容量瓶中，用少量水分次淋洗烧杯，淋洗液一并移人容量瓶，再用水定容到
刻度，混匀，制备成奶粉复原乳试样.
6.2试样的保存
将试样于4C以下保存.
7测定步骤
7.1提取与净化
准确称取5g牛奶试样（精确到0.01g）或量取5.00mL奶粉复原乳试样（6.1.2）于50mL具塞离心管中，加人20mL提取液（4.9）盖上盖混匀.置于振荡器上以300r/min振荡10min，在离心机中以10000r/min离心5min.将上层溶液用滤纸过滤于鸡心瓶，残渣再用20mL提取液（4.9）超声提取发至近干（约剩余2mL以下），剩余液转移至10mL具塞刻度离心管中，用甲醇（4.1）洗涤鸡心瓶，合并 溶液并用甲醇（4.1）定容至5.00mL，旋涡混匀1min，然后加入5mL饱和了80%甲醇水的正已烷溶液（4.8），旋涡混匀1min，以3000r/min离心3min，弃去上层正已烷层，再加人5mL饱和了80%甲醇水的正己烷溶液（4.8），旋涡混匀1min，以3000r/min离心3min，取下层溶液过0.2μm滤膜（4.14），供液相色谱-中联质谱测定.
7.2阴性样品提取液的制备
取不含氮氨非啶的阴性牛奶或者奶粉样品，按7.1步骤制备阴性样品提取液，用于配制氮氨菲啶基质标准工作溶液，
7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：Acquity UPLCTBEH C1. 7 μm，100mm×2.1 mm（内径）或相当者： 液相色谱参考条件如下：b）柱温：35C；
c）进样量：5uL；
d）流动相及流速见表1.
表1液相色谱梯度洗脱条件
流速/(mL/min) 水（含0.2%的甲酸/% 甲醇/%0 00 3 00 0.3 0 3 90 10 Initial 64 00 0.3 90 64 50 0 3 10 65 00 0.3 10 1
7.3.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
b）扫描方式：正离子扫描； a）离子源：电喷雾离子源（ESI）；c) 检测方式：多反应监测（MRM）：d) 毛细管电压：1.00kV；锥孔电压：31V；离子源温度：110C： 脱溶剂温度：400C；g) h) 脱溶剂气流量：450L/h：i） 摊孔气流量：501/h;j）碰撞室压力：0.415Pa；1）氮氨菲啶定量离子对、定性离子对及碰撞能量见表2. k) 碰撞气氧气；
表2氮氮菲啶定性离子对、定量离子对、碰撞能量及驻留时间
定量离子对（m/z） 定性离子对（m/z) 碰撞能量/eV 驻留时间/s460 4/298.5 23 0 30460 4/298 5 460 4/313 6 21 0 30
7.3.3液相色谱-串联质谱测定
7.3.3.1定性测定
留时间相差在土2.5%以内，且样品色谱图中定性离子的相对丰度与浓度相近的基质标准工作溶液色 在相同的实验条件下进行样品测定时，如果样品中待测物质的色谱峰保留时间与标准品色谱峰保谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，相对偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在该种待测物.
表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度K 0<Y 20<K<50 10<K<20 K≤10允许最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 7.3.3.2定量测定 在仪器最佳工作条件下，对氮氨菲啶基质标准工作溶液（4.13）进行色谱分析，以峰面积为纵坐标，基质标准工作溶液浓度为横坐标绘制，用标准工作曲线对样品进行定量，基质标准工作溶液和样液中氮氨菲啶的响应值均应在仪器测定的线性范围内.在上述色谱和质谱条件下，氮氨菲啶的参考保留时间
