中华人民共和国国家标准
GB/T22976-2008
牛奶和奶粉中α-群勃龙、-群勃龙、19- 乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination of a-trenbolone，β-trenbolone nortestosterone andepi-nortestosterone residues in milk and milk powder-LC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.
本标准负责起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：艾连峰、王风池、段文仲、郭春海、马育松、贾海涛、刘宝圣、勾金玉、庞国芳.
牛奶和奶粉中α-群勃龙、群勃龙、19- 乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛奶和奶粉中α群勃龙、群勃龙、19-乙烯去甲率酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的高效液相色谱-串联质谱测定方法.
的测定和确证. 本标准适用于牛奶和奶粉中α群勃龙、B-群勃龙、19-乙烯去甲率酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留量
本标准方法的检出限：牛奶中α-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮为1 μg/kg，奶粉中α-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲皋酮为5μg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
2004 ISO 5725-1:1994 IDT) GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1一
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987，MOD）
3原理
试样在pH5.0条件下加酶水解，乙睛-乙酸乙酯提取，凝胶色谱净化，用高效液相色谱-串联质谱测定，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为液相色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水，
4.1乙睛.4.3环已烷. 4.2乙酸乙酯.4.4甲醇.4.5乙酸.4.6无水硫酸钠，分析纯：经650C灼烧4h，置于干燥器内备用.4.8β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶：β-glucuronidase/aryl sulfatase， 100 00 unit/mL. 4.7乙酸钠，分析纯.4.90.02mol/L乙酸钠缓冲液（pH=5.0）：称取无水乙酸钠0.82g溶于500mL水中，用乙酸调节pH=5.0
GB/T 22976-2008
4.10甲醇溶液（73）：30体积的水与70体积的甲醇混匀.4.11乙酸乙酯-环已烷（11）;50体积的乙酸乙酯与50体积的环已烷混匀.4.12α群勃龙（α-trenbolone，CAS:80657-17-6)、β-群勃龙（β-trenbolone，CAS：10161-33-8)、19-乙烯去甲 睾酮（nortestosteroneCAS：434-22-0）和 epi-19-乙烯去甲睾酮（epi-nortestosteroneCAS:4409-34-1）标准品：纯度大于等于98%.4.13标准储备液：分别精确称取适量标准品，用乙配制成100pg/mL的标准储备液.4.14混合标准中间工作液：取标准储备液（4.13）各1mL至100mL容量瓶中，用乙定容至刻度，配 制成混合标准工作液，浓度为1μg/mL.4.15滤膜；0.45 μ.
5仪器和设备
5.1高效液相色谱-中联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）.5.2凝胶色谱仪.5.3分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.4离心机.5.5恒温水浴摇床. 5.6涡旋混和器.5.7旋转蒸发仪.
6试样的制备与保存
6.1牛奶
取均匀样品约250g装人洁净容器作为试样，密封置4C下保存，并标明标记.
取均匀样品约250g装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记.
7测定步额
7.1提取
并加人5mL水于50mL具塞离心管中，混匀.
在称取好样品的离心管中加人5mL乙酸钠缓冲液和20Lβ-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，摇匀后盖好塞子置于恒温水浴摇床上，37C振荡水解过夜.待水解液冷却至室温后，首先加人5mL乙，振据，以沉淀蛋白，然后再加入20mL乙酸乙酯，涡旋振荡提取2min后，3000r/min离心10min，移取鸡心瓶中. 上清液通过5g无水硫酸钠过滤至鸡心瓶中.再用20mL乙酸乙酯重复提取一次，合并上清液于同一
7.2净化
7.2.1凝胶色谱参考条件
凝胶色谱参考条件如下：
a）净化柱：22gS-X;Bio-Beads填料.200mm×25mm（内径）或相当者；b）流动相：乙酸乙酯-环己烷（4.11）.流速：5.0mL/min;c）定量环：5mL；d）净化程序：0min~10min弃去洗脱液，10min~15.5min收集洗脱液.
7.2.2凝胶色谱净化
将提取液在45C下蒸至近干，用乙酸乙酯-环已烷（11）定容至10mL的玻璃试管中，按7.2.1的条件净化.净化后将收集的洗脱液蒸干，用1mL甲醇溶液（4.10）旋涡振荡溶解，过0.45μm滤膜供2
HPLC-MS-MS 分析
7.3空白基质溶液的制备
将取牛奶阴性样品5g，奶粉阴性样品1g（精确到0.01g）.按7.1和7.2操作.
7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
b）色谱柱温度：30C； a）色谱柱：Cs5pm.150mm×2.1mm（内径）或相当者；进样量：20u;d) 流动相梯度及流速见表1.
表1液相色谱梯度洗脱条件
回 0. 00 流速/(μL/min) 200 0.1%乙酸水溶液/% 08 乙晴/% 206 00 200 65 358 00 200 65 358 10 200 08 2010.0 200 80 20
7.4.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a）离子化模式：电喷雾正离子模式（ES1）； b） 质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；c) 鞘气压力：104kPa；辅助气压力：138kPa；e) f) 正离子模式电喷雾电压（IS）：4000V； 毛细管温度：320C；g) 源内诱导解离电压：10V；Q1为0.4，Q3为0.7；i 碰撞气压力：0.2Pa； 碰撞气：高纯氢气：k）其他质谱参数见表2.
表2被测物的参考保留时间、采集窗口、监测离子对和裂解能量
化合物名称 保留时间/min 检测离子对（m/=） 裂解能量/eV3群勃龙 8 93 271 16/253 08* 21271 16/199 08 21-群勃龙 9 47 271 16/253 08* 271 16/199 08 21 21275 18/239 10* 1519-乙烯去甲率酮 10 28 275 18/257 12 25275 18/239 10* 15epi-19-乙烯去甲睾酮 11.64 275 18/257 12 25为定量离子对，对于不同质谱仪器，仅器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳.
