中华人民共和国国家标准
GB/T 22992-2008
牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、 已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination ofzearalanol zearalanone diethylstilbestrol hexestrol anddienoestrol multi-residues in milk and milk powder-LC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：许泓、吴延晖、何佳、张骏、张曼、林安清、庞国芳.
牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、 已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚 液相色谱-串联质谱法 残留量的测定
1范围
本标准规定了牛奶和奶粉中玉米赤霉醇（zearalanol）、玉米赤霉酮（zearalanone）、已烯雌酚（dieth-ylstilbestrol）、己烷雌酚（hexestrol）、双烯雌酚（dieno-estrol）残留量液相色谱-串联质谱测定方法.
本标准方法检出限：牛奶中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烷雌酚、已烯雌酚和双烯雌酚为1.0ug/L：奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烷雌酚、已烯雌酚和双烯雌酚为8.Oμg/kg.
2规范性引用文件
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1:1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987.MOD）
3原理
用乙晴作为蛋白沉淀剂和提取剂进行提取，阴离子固相萃取柱进行净化，用液相色谱-中联质谱仪测定，内标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯.
4.1水：GB/T6682，一级.4.2甲醇：色谱纯.4.3乙睛：色谱纯.4.5甲酸. 4.4氨水.4.6氢氧化钠.4.75mol/L氢氧化钠溶液：称取200g氢氧化钠，用蒸馏水定容到1L.4.8淋洗液：氨水-水（119）.4.9洗脱液：甲酸-甲醇（119），
4.10激素及代谢物标准物质：玉米赤霉醇（包括α玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇，各50%）纯度大于等于97%；玉米赤霉酮，纯度大于等于97%；已烯雌酚，纯度大于等于99%；已烷雌酚，纯度大于等于
98%；双烯雌酚，纯度大于等于98%.4.11标准溶液：分别准确称取适量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚标准物作为标准工作溶液，保存于4C冰箱中. 质，用甲醇（4.2）配制成1mg/mL标准贮备溶液.再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准溶液4.12内标标准物质：α玉米赤霉烯醇-4氛代，纯度大于等于99%：已烯雌酚-8氛代，纯度大于等于98%4.13内标标准溶液：准确称取适量玉米赤霉烯醇-4尔代和己烯雌酚-8氛代标准物质，用甲醇（4.2）分箱中. 别配制成1mg/mL标准贮备溶液.再以甲醇稀释成适用浓度的混合内标工作溶液，保存于4C冰4.14基质提取液：空白样品，除不加人标准工作溶液（4.11）和内标工作溶液（4.13）外，其他操作同7.1.1及7.1.2处理后得到的溶液.4.15基质标准工作溶液：将标准工作溶液（4.11)及内标工作溶液（4.13）混合后在氮吹仪中吹干，以基4.16OasisMAX阴离子固相萃取柱"或相当者：60mg，3mL. 质提取液（4.14）溶解，涡旋30s后即为基质标准工作溶液.4.17滤膜：0.2 yum.
5仪器
5.1液相色谱-中联质谱联用仪：配有电喷雾电离源.5.2自动固相萃取仪或固相萃取装置.5.3氮气吹干仪.5.4涡旋振荡器.5.5离心机：转速大于3500r/min5.6高速离心机：转速大于9000r/min，温度可控制在4C.
6试样的制备
6.1牛奶
取50mL新鲜或解冻的牛奶混合均匀，3500r/min离心5min，取下层.
取12.5g奶粉于烧杯中，加适量35C~50C水将其慢慢溶解，转移至100mL容量瓶中，待冷却至室温，用水定容混匀.取50mL，以3500r/min离心5min，取下层.
7测定步骤
7.1混合基质标准校准溶液的制备
7.1.1样品量取
于50mL离心管中，分别加人不同量混合标准工作溶液（4.11），使各被测组分玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烷雌酚、已烯雌酚和双烯雌酚的浓度为2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50 ng/mL-再分别加人适量内标标准工作溶液（4.13），使其浓度均为10ng/mL，在氮吹仪上于40C水 浴中吹干.取5个阴性样品，每个样品为5mL，置于上述离心管中涡旋混合后，加10mL乙晴，涡旋混合3min，3500r/min离心10min，取上清液于离心管中，再向样品中加人5mL乙，同前操作，合并提取液，50C下氮吹至体积小于0.1mL.加水10mL.用5mol/LNaOH调节pH至11.0，4C，
9000r/min离心5min，备用.
7.1.2提取净化
清液上柱-流速为1mL/min，依次用1mL淋洗液（4.8）、0.5mL甲醇以3mL/min的速度淋洗，通人 固相萃取净化条件：先用2mL甲醇、2mL水将柱子活化，流速均为4mL/min.将7.1.1样品上20mL空气以4mL/min的速度吹过OasisMAX柱.用4ml洗脱液（4.9）洗脱，流速为1mL/min，加人30mL空气以6mL/min的速度吹过Oasis MAX柱，收集洗脱液.将洗脱液在氮吹仪上于40T水浴中吹干，加人1mL流动相，涡旋30s溶解.溶液过0.2gm滤膜后，供液相色谱-申联质谱测定，
7.2实测样品溶液的制备
取待测样品5mL于50mL离心管中，加人适量内标标准工作溶液（4.13）.使其最终定容浓度均为10 ng/mL按7.1.1及7.1.2操作.
7.3空白基质溶液的制备
取阴性样品5mL于50mL离心管中，按7.1.1及7.1.2操作.
7.4测定条件
7.4.1液相色谱条件
液相色谱条件如下：a）色谱柱：ZORBAX EclipseSB-C3.5μm，150mmX4.6mm（内径）或相当者；b）柱温：25C；c）流动相：乙晴-水（73）； d）流速：0.5mL/min;e）进样量：50.
7.4.2质谱条件
质谱条件如下：
a）离子化方式：电喷雾电离： b）扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）：(P 离子源温度：350C；e) 雾化气压力：0.083MPa；g）辅助气1压力：0.2756MPa; f) 气帘气压力：0.1240MPa；h）辅助气2压力：0.2412 MPa；i）喷雾器电流：-5μA；j）电喷雾电压：-4500V；k）定性离子对、定量离子对、碰撞能量和去簇电压见表1.
表15种激素及代谢物的定性离子对、定量离子对、碰撞能量和去缺电压
化合物名称 定性离子对（m/=） 定量离子对（m/=） 碰撞能量/V 去额电压/V320 6/277. 2 42 110玉米素霉醇 321.1/161 0 321 1/277.2 40 100318 7/160. 8 40 110玉米素霉酮 318 7/107 0 318 7/160 8 45 110玉米素霉烯 322. 9/159. 9 322 9/159 9 50 90醇-4氛代 322 9/130 1 43 90
