中华人民共和国国家标准
GB/T22995-2008
蜂蜜中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素 残留量的测定液相色谱-串联质谱法
Determination of streptomycin.dihydrostreptomycin andkanamycin residues in honey-LC-MS-MS method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局.本标准主要起草人：刘晓茂、张守军、张进杰、曹彦忠、曹亚平、孙海侠、庞国芳.
蜂蜜中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素 残留量的测定液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了蜂密中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量液相色谱-中联质谱测定方法.本标准适用于蜂密中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定. 本标准的方法检出限：链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的检出限均为5.0yg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1:1994 IDT)
性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994 IDT)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987.MOD）
3原理
相当者净化.液相色谱-中联质谱仪（ESI）检测，外标法定量. 蜂蜜试样中的抗生素用磷酸盐缓冲溶液提取，用OasisHLB固相萃取柱和羧酸型固相萃取柱或
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯.
4.1水：GB/T 6682，一级. 4.2甲醇：色谱纯.4.3乙晴：色谱纯.4.4甲酸.4.5磷酸氢二钾，KHPO4.70.2mol/L磷酸盐缓冲溶液：pH=8.0.称取34.8g磷酸氢二钾（4.5），用水溶解，定容至1L，用 4.6庚烷磺酸钠，CHNaO SHO磷酸调节pH=8.0 4.80.01mol/L庚烷磺酸钠溶液：称取2.20g庚烷磺酸钠（4.6），用水溶解，定容至1L.001（2）由（）由%00 4.9SPE洗脱溶液：取4mL甲酸（4.4），用0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液（4.8）定容至100mL.4.11标准物质：链霉素（CAS：3810-74-0)、双氢链霉素（CAS：128-46-1）和卡那霉素（CAS：25389-94-0)；纯度均大于等于98%.
1）Oasis HLB国相萃取柱是Waters公司产品的商品名称.给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可，如果其他产品具有相同的效果.则可使用这些等效产品.
4.121.0mg/mL标准储备溶液：称取适量的链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准物质（4.11），分别用0.3%乙酸水溶液溶解并配制成1.0mg/mL的标准储备溶液.避光保存于一18C冰柜中.0.3%乙酸水溶液稀释成0.1μg/mL的混合标准溶液，避光保存于-18C冰柜中. 4.130.1μg/mL混合标准溶液：吸取适量链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准储备溶液（4.12）、用4.14OasisHLB固相萃取柱（60mg，3mL）或相当者：使用前依次用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润.4.15羧酸型固相萃取柱（500mg，3mL）或相当者：使用前依次用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润.4.16混膜；0.2 yum.
5仪器
5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源.5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.3液体混匀器.5.5均质器. 5.4固相萃取装置.5.6真空泵：真空度应达到80kPa.5.7微量注射器：25gL，100pL.5.8pH计：测量精度士0.02pH单位.5.9三角瓶：200mL.5.10贮液器：50mL.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
实验室样品混合均匀，分出0.5kg作为试样.
6.2试样保存
试样置于-18C冰柜，避光保存.
7测定步骤
7.1待测样品溶液的制备
称取蜂蜜样品10g（精确到0.01g），置于200mL三角瓶中，加入20mL0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液（4.7），误旋混合5 min后，全部倒入下接Oasis HLB固相萃取柱（4. 14）的贮液器中，此Oasis HLB2mL/min的流速依次通过OasisHLB固相萃取柱（4.14）和羧酸型固相萃取柱（4.15），待样液全部通 固相萃取柱（4.14）下面用适配器接羧酸型固相萃取柱（4.15），在固相萃取装置上使样液以小于过两支固相萃取柱后，依次用10mL水和10mL20%甲醇溶液（4.10）洗涤两支固相萃取柱，弃去全部流出液和OasisHLB固相萃取柱（4.14）.减压抽干羧酸型固相萃取柱（4.15）30min.用2mLSPE洗脱液（4.9）洗脱至5mL刻度离心管中.用SPE洗脱液（4.9）定容至2.0mL.混匀后过0.2pm滤膜(4.16），供液相色谱-中联质谱测定.
7.2基质混合标准校准溶液的制备
称取五个阴性蜂蜜样品10g（精确到0.01g），分别置于200mL三角瓶加人适量混合标准溶液（4.13），制成链霉素、双氢链霉素和卡那霉素含量均为2.5μg/kg、5.0μg/kg、10.0pg/kg、50.0μg/kg2
和100.0pg/kg的基质标准溶液.其余按7.1步骤操作完成.
7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：Atlantis C3.5μm，150 mm×2.1mm（内径）或相当者：b）柱温：40C；进样量：30l;d) 流动相：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙溶液，流动相C为甲醇. 梯度洗脱参考条件见表1.
表1液相色谱梯度洗脱参考条件
时间/min 说速/（μl/min） 流动相A/% 流动相B/% 流动相C/%0 200 85 10 5200 60 35 56 00 200 60 35 56 01 200 85 10 516 00 200 85 10 5
7.3.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
离子源：电喷雾离子源（ESI）：扫描方式：正离子扫描；c) 检测方式：多反应监测（MRM）：d) 输助气（AUX）流速：71/min； 电喷雾电压（IS）：5000V；e) f) 输助气温度（TEM）：550C：g) 聚焦电压（FP）：150V：h) 链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的质谱参数见表2.
表2链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的质谱参数
化合物名称 定性离子对 （/=） 定量高子对 （m/=） 去策电压 A/(dI) 采集时间/ ms 碰撞能量 (CE)/V盛司素 582/263 45(streptomycin ) 582/246 582/263 110 100 55双氢盛萄素 584/263 43(dihydrostreptomycin) 584/246 584/263 100 100 55卡那霉素 485/163 485/163 50 100 34(kanamyin) 485/324 23
7.4液相色谱-串联质谱测定
7.4.1定性确证
每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合基质标准校准溶液中对应组分的保留时间偏差在土2.5%之内：且样品谱图中各组分的相对离子丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的相对离子丰度进行比较，偏差不超过表3规定
